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乳腺癌细胞p16基因的研究

来源:中华外科杂志
摘要:摘要目的:探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。方法:采用细胞培养,反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞,经多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析技术,对14例纯化乳腺癌细胞标本、14例新鲜未纯化标本和27例石蜡包埋标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因突变率进行了对比性研究。结果:纯化的......

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   摘 要 目的:探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。方法:采用细胞培养,反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞,经多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析技术,对14例纯化乳腺癌细胞标本、14例新鲜未纯化标本和27例石蜡包埋标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因突变率进行了对比性研究。结果:纯化的乳腺癌细胞组p16基因突变率为42.9%(6/14),而新鲜未纯化细胞组、石蜡包埋细胞组及癌旁乳腺细胞组的p16基因突变率分别为7.1%、7.4%、4.9%,纯化乳腺癌细胞组的突变检出率显著高于其它3组,差异有显著性意义(P<0.01),其它3组突变检出率差异无显著意义(P>0.05)。结论:在原发性乳腺癌中p16基因的纯合性缺失和小片段基因丢失可能是其失活的主要模式;纯化的癌细胞标本可大大提高p16基因的突变检出率。

  我们采用细胞培养,反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞,经多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析技术对14例纯化乳腺癌细胞标本,14例新鲜未纯化乳腺癌标本,27例中性福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因的3对外显子进行了检测。以探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。

  资料与方法

  1.标本:41例原发性乳腺癌标本为我院1997~1998年的手术患者,均为女性;年龄35~68岁。其中27例乳腺癌组织常规取材,经中性福尔马林固定12 h后,石蜡包埋,连续切片11张,1张行HE染色,10张经充分剔除周围非肿瘤组织后,留置作DNA抽提;14例术中取癌组织冰冻病理检查,对照HE染色,选取无坏死的肿瘤细胞集中部分取材,立即置入Hank′s液中,4℃冰箱暂存不超过24 h。所有病例均取癌旁乳腺组织标本置-20℃冰箱冻存。

  2.实验材料与方法:12孔、24孔细胞培养板;CO2细胞培养恒温箱;倒置微生物显微镜;-20℃、-80 ℃低温冰箱;层流超净工作台;PCR仪;DYY-Ⅲ型稳压电泳仪;DYY-Ⅲ6型转移电泳仪;Hoefer mighty SmallⅡ电泳系统;紫外分光光度计。PCR引物由中科院上海植物生理所植物分子遗传实验室合成。引物序列参见文献[1,2]。

  细胞培养、反复贴壁纯化癌细胞法按文献[3]方法。模板DNA的制备按文献[4,5]方法。所有DNA样本经紫外分光光度检测波长为260 nm及230 nm处的OD值,OD值均大于1.8。多聚酶链反应(PCR)按文献[2,5]方法。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳、鉴定。PCR产物的SSCP分析按文献[6]的方法。

  3.统计学方法:用Fisher′s精确概率计算法(sas6.08),结果经t检验

  结 果

  实验中建立了稳定的p16基因1~3外显子(exon)片断的PCR-SSCP检测体系。在27例石蜡包埋原发性乳腺癌标本中,1例p16基因exon1~3未见相应的扩增片段;1例exon 3未见扩增片段。14例新鲜未纯化癌标本中,1例未见exon1,1例未见exon 3相应的扩增片段。14例纯化癌细胞标本中,1例exon1~3均未见扩增片段,2例未见exon 1~2扩增片段,2例未见exon 3扩增片段。在全部扩增阳性癌标本中,仅有1例纯化癌细胞标本的p16基因第2 exon出现异常SSCP泳动条带。

  纯化癌细胞组p16基因突变率为42.9%(6/14),石蜡包埋癌细胞组、新鲜未纯化癌细胞组及癌旁乳腺组织细胞组分别为7.4%、7.1%、4.9%,纯化癌细胞组突变检出率显著高于其他3组,差异有显著性意义(P<0.01),其他3组之间差异无显著意义(P>0.05)。

作者: 王本忠朱新生 2004-9-23
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