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梅毒常见实验室诊断方法及其进展

来源:国外医学皮肤性病学分册
摘要:摘要近年来梅毒的发病率有逐年增加的趋势、研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法是当前主要研究热点,而设计新试剂盒的关键在于,对现有试剂盒优、缺点的认识和改良,利用人工合成梅毒螺旋体原设计出新的检测方法。对梅毒螺旋体抗原的分析及人工合成,国外早在1989年就已开始进行,几年来发展迅速,目前已有......

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  摘要 近年来梅毒的发病率有逐年增加的趋势、研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法是当前主要研究热点,而设计新试剂盒的关键在于,对现有试剂盒优、缺点的认识和改良,利用人工合成梅毒螺旋体原设计出新的检测方法。对梅毒螺旋体抗原的分析及人工合成,国外早在1989年就已开始进行,几年来发展迅速,目前已有各种针对不同需要的试剂盒。

  目前虽然各国之间梅毒流行的情况送别很大,但它依旧是十分重要的社会和医学问题[1]。近年来,大多数欧洲国家梅毒发病率显著下降,已小于2/10万。但在前苏联国家中,梅毒的发病率却显著上升,如俄罗斯梅毒的发病率大于32/10万[2]。即使在美国,在特定的种族人群中梅毒的发病率依然很高[3]。在我国,梅毒的发病率逐年增多,所以研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法,对该病的防治有着重要的意义。现对目前已有诊断方法的优缺点,以及最新诊断方法作一综述。

梅毒常用诊断方法

  (一)检查梅毒螺旋体:可用病损处的渗出液进行暗视野、涂片银染色、免疫荧光染色、家兔感染试验(RIT)或PCR法检测,以及用酶免疫法(EIA)理论设计的,利用单克隆抗体检验梅毒螺旋体的方法,如Visuwell试验[4]。①暗视野显微镜检查由于对取材、检查技术要求较高;并且在口腔及肛门部位有口腔螺旋体、大齿密螺旋体、小齿密螺旋体及生殖器螺旋体等其他条件致病螺旋体存在,暗视野检查时不易与它们区分;此外梅毒螺旋体本身很脆弱,容易受外界条件如服用过抗生素、病损处外用一些化学药物等的影响,该方法敏感性较低,所以暗视野检查阳性也不能排除梅毒的可能性。但由于它特异性很高,经过训练的检验人员在暗视野显微镜下看到形态典型的梅毒螺旋体,结合临床症状即可作出早期诊断。②镀银染色法检查螺旋体,适用于缺乏暗神显微镜的基层单位。③免疫荧光染色是用抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体,加非致病性螺旋体培养物进行吸收,再与异硫氰酸荧光素(FITC)相结合,用此方法来染梅毒螺旋体,在荧光显微镜下读结果,阳性者可见绿色荧光螺旋体,其优点是可区分梅毒螺旋体与其他条件致病性螺旋体,对口腔、肛门等部位的损害有鉴别价值,且敏感性亦有所提高。④RIT是利用家兔对梅毒螺旋体的易感性,把梅毒螺旋体注射于成年新西兰白兔睾丸内,观察有无感染亦象。RIT是经典的梅毒诊断方法,由于其费用高、检查时间长等弊病目前仅用于科学研究。⑤PCR法是较新的方法,它能对生殖器溃疡早期鉴别诊断,区分梅毒、生殖器疱疹及软下疳[5]。它可分为PCR和RTPCR,PCR的设计主要针对编码梅毒螺旋本特异性抗原和TpN47(Tpp47)的DNA开放编码区,常见的引物设计见附表。

  由于在PCR中会偶然出现非特异的PCR产物而干扰结果,这就必须用特异性的DNA探针进行DNA-DNA杂交来提高PCR的特异性及敏感性。此外用TpN47设计的PCR,由于TpN47的保守性,雅司螺旋体可产生类似的PCR产物,所以这种设计的PCR不能区分梅毒和雅司;但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体,这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题[6]。另一种是RT-PCR,常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA 366bp片段[7],这种方法污染少,特异性敏感性高,但价格稍高。PCR在梅毒持续感染中的诊断价值目前尚无一致意见,理论上PCR可查出死亡的TP,所以治疗后PCR阳性并不意味着治疗失败,但死亡的TP从机体内清除较快(15~30天),而存活的TP从机体内清除至少需120天,所以治疗数周后PCR阳性意味着持续感染的可能[8]。

附表:针对编码梅毒螺旋47-kD抗原基因设计的常用引物起莱姆病的

引物名 引物序列 产物
KO3A 5´-GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT(537-559) 261bp
KO4 5´-CAGAGCCTCAGCCCTTTTCA(797-776)  
47-1 5´-GACAATGCTCACTGAGGATAGT(648-669) 658bp
47-2 3´-ACGCACAGAACCGATTCCTTG(1284-1305)  
47-3 5´-TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC 496bp
47-4 3´-TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT(1187-1208)  

  (二)梅毒血清试验:梅毒螺旋体感染机体后可产生两种抗体,一种是抗心磷脂抗体,即非特异性抗体,亦称反应素,主要方法有性病研究实验室试验(VDRI)、血清不需加热的反应素试验(USR)和快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)以及Capture-S试验——一种非螺旋体抗体因相红细胞吸附试验[9]。这种抗体滴度与梅毒活动有关,临床上主要用于观察疗效,复发及再感染。另一种是抗梅螺旋体抗体,即特异性抗体,主要有IgM和IgG检测方法有荧光螺旋抗体吸收试验(FTA-ABS)及梅毒螺旋体血凝试验(TPHA),以及利用螺旋体天然抗体原依照EIA原理设计的Captia select Syph-G试验[10],和新近出现的利用梅毒螺旋体合成抗原(TpH15、TpN17、TpN47)设计的ICE syphilis EIA试验和Syphilis Fast试验[12]。这些方法一般用于梅毒的确认试验,由于检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体,所以即使患者经足够的抗梅毒治疗,血清反应仍保持阳性。而近年来发展的检测抗梅毒螺旋体IgM抗体,却能早期诊断及判断疗效。主要方法有:①19S-IgM-荧光抗体吸收试验(19S-IgM-FTA-ABS):先用高压液相色谱或其他方法分离标本中的IgM,然后再做FTA-ABS,其特异性与敏感性均很高,但价格昂贵不易推广。②IgM固相血凝试验(IgM-SPHA)和梅毒螺旋体特异性IgM血凝试验(TP-IgM-HA)均是对现有方法的改良,要求事先分离IgM抗体。③梅毒特异性IgM抗体捕捉ELISA试验(IgM-CAP-ELISA)[13]:此方法是利用间接ELISA的原理,扰抗人IgM单抗包被在微量滴定板或其它固相载体上,加入待检血清以捕捉其中的IgM,再先后加入超声粉碎或基因重组获得的梅毒螺旋体抗原、生物素标记的抗梅毒螺旋体单抗、辣根过氧化物酶标记的链亲和素及底物,最后通过显色判定结果。④SDS-PAGE及免疫印迹法:把梅毒螺旋体溶解后的悬液或Triton x-114提取液,点于SDS-多聚丙烯酰胺凝胶中电泳,电泳后转移至硝酸纤维膜上,分别加入等检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM或IgG抗体、底物4-氯萘酚,当出现72、47、45、42、37、17、15kD中的一条或多条显色带即判定为阳性[14]。由于梅毒感染后血循环中首先产生的是IgM抗体,并且IgM抗体不能通过胎盘,而且梅毒患者抗TPIgM抗体的出现与梅毒的复发再感染或活动性有关,所以IgM抗体检测试验是早期梅毒、胎传梅毒诊断和疗效观察的十分敏感和特异的方法,通过检测抗TP igM抗体可提示是梅毒活动还是静止以及是否需要治疗等。

作者: 佚名 2004-9-24
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