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食品沙门氏菌检测方法进展

来源:中国人兽共患病杂志
摘要:沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,其病原沙门氏菌属肠道细菌科,包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介,感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况,受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例,要求对易受......

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  沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,其病原沙门氏菌属肠道细菌科,包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外,还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态,也可表现为有临床症状的致死疾病,它可能加重病态或死亡率,或者降低动物的繁殖生产力。

  蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介,感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况,受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例,要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理,以使大多数食物不含沙门氏菌,从而有效预防沙门氏菌病。为此,人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中,作出了不懈的努力,现将有关进展报告如下,并介绍两种快速检测沙门氏菌的试剂盒。

  自19世纪后期,沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来,检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间,用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一,通常,沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多;第二,食品本身的性质会干扰病原的检测,例如,某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平,从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定;第三,与临床病料不同的是,经过加工的食品,由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用,其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响,因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难,人们建立了一种简单的微生物增殖步骤,专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的,但却很费力、耗时,需要4~7天才能完成。因此,在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时,通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展,近10~15年间发展了无数改进的方法,其中许多可以在48h内检出沙门氏菌,这些方法通称为快速检测。

  1 传统的培养方法

  用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌,以增加病原的可检出率,这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌),将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中,温度37℃,使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定),但对培养基的选择仍存有争论。第二,是选择性增菌步骤,它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少,与预增菌培养基相似,对选择性培养基的选择,也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型:连四硫基盐肉汤(Tetrathionate broth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型,所以,较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤,即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养,然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认,并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测,以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4~7天,才能得出明确的诊断结果。

  2 以抗体为基础的检测方法

  利用抗原-抗体反应的显著特异性,来进行细菌的鉴别和血清学定型,已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在,使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种,大致可分为以酶标抗体(ELISA),荧光抗体染色(免疫荧光法),同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础,利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体,概括地说,是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原,经洗涤除去未结合的成分,加入第二种酶标抗体,此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上,第二次洗涤后加入酶作用基质,并令其与颜色成分反应,然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化,并促成其自动化。

  最近黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板,加入经增菌处理的样品,反应后再加入一定的指示剂,作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理,也可用此法进行沙门氏菌检测。

  ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105~106个细胞/ml,因此,要得出可靠的结果,食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌,通常还要在含有D-甘露糖的肉汤(M肉汤)中进行后增菌,以促进鞭毛发育。总的来说,标准的ELISA法样品的制备,约需要经过40~48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)样品制备过程分三步,共耗时24h:①选用营养肉汤进行预增菌(6h),使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。②使用选择性培养基RV进行增菌(14h),使沙门氏菌大量繁殖,同时抑制其它杂菌生长。③使用营养肉汤(蛋白胨水)进行后增菌(4h),使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身,则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间,90min是孵育时间)。相比之下,黎兆滚等人的方法可在27h内完成,比上述方法缩短了一半的时间,颇值得推广应用。

  最新式的沙门氏菌免疫学检测法,利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上,结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作,且由于无需要特殊设备,很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理,但它(卡片法)本身通常需时不超过10min,如果采用黎兆滚等人的样品制备法,则可使操作时间更为缩短。

作者: 佚名 2004-9-24
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