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应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价

来源:中国免疫学杂志
摘要:应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群,操作简单、快速、重复性好,对及时掌握最佳采集时机,准确判断采集的干/祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及APBSC中的CD34+细胞,本文比较了几种FACS检测CD34+细胞方法的异同。1材料与方法1。1外周血造......

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  应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群,操作简单、快速、重复性好,对及时掌握最佳采集时机,准确判断采集的干 /祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及 APBSC中的CD34+细胞,本文比较了几种 FACS检测CD34+细胞方法的异同。

  1 材料与方法

  1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺(CTX)+重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的实体瘤患者(淋巴瘤、乳腺癌),采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机(Baxter公司,美国)。

  1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。

  1.2.1 溶血法  APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体(Immunotec,法国)室温暗处反应15 min,然后用细胞裂解液溶解红细胞,待测。

  1.2.2  分离单个核细胞法 经Ficoll(相对密度1.007)梯度离心,收集界面层单个核细胞,与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min,待测。

  1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管,其中一管 6 h内使用流式细胞仪(EPICS ELITE ESP, COULTER公司)测定CD34+细胞占单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的百分率,另一管经 1%多聚甲醛固定, 4℃冰箱保存72 h后, FACS测定CD34+ 细胞数。

  1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10(ClassⅡ,Immunotec)和表达第3类抗原表位 8G12( HPCA2,classⅢ,Becton Dickinson)的单抗进行标记,比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。

  1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC(J33)和抗CD34-PE(HPCA2),用溶血法处理细胞, FACS测定CD34+细胞。

  1.6 统计学处理 用 t检验

  2 结果

  2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异(P>0.50)。

  2.2 同一样品经 1%多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比,CD34+细胞荧光强度降低,非特异吸附增加,变异系数范围在 9.9%~49.5%之间,平均CV值为 32.2%。

  2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记,CD34+细胞百分率无显著性差异(P>0.05)。

  2.4 CD34-PE/CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5%,而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3%。

  3 讨论

  FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义,但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少,标本保存(冷冻)、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果[1]。本研究对样品固定前、后测定,CV值明显大于批内变异,应在 1%~ 6%,批间变异<20%的国际质控标准[2]。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异,但溶血法较分离单个核细胞法简单,避免了细胞损伤,使细胞回收率提高[2],更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类,其抗原表达亦有差异,应用针对不同表位的抗体测定CD34+细胞,结果是否有差异,则报道不一[3,4]。本研究的结果表明无显著性差异。

  各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法,必然会产生较大的室间差异,Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析,结果差异很大,CD34+细胞为∶ 0.08%~19.31%,CV值为100.1%~136.6%[1]。1995年初,国际血液治疗与移植工程协会(ISHAGE)成立了干细胞计数委员会,建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法[5],建议双标记CD34-PE/CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率,因为白细胞共同抗原CD45在造血干/祖细胞上的表达明显减弱,CD45和侧向散射光(SSC)一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开[4]。此外还可以同时结合第3种荧光抗体,测定CD34+细胞亚群[5]。

  应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体,CD34单抗结合PE效果要强于 FITC[6];由于CD34+细胞表达很少,应计数尽可能多的细胞,以提高结果的准确性[7];标本应新鲜测定;同时标记CD45,可提高检测CD34+细胞的准确性。

作者: 韩晓红石远凯刘鹏王军冯奉仪 2004-9-24
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