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抗HBV核酶的研究进展

来源:国外医学卫生学分册
摘要:乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙型肝炎的病原体。在我国HBV感觉率达10%,而传统的抗病毒药物远期疗效均不显著,寻找新型抗HBV药物成为迫切需要。核酶(Ribozyme)是一类具有生物催化功能的RNA,可定点切割RNA靶分子,从而达到有效阻断基因表达的目的[1]。通过合理的设计及操作,核酶可阻断HBV的复制及表达。...

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  乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙型肝炎的病原体。在我国HBV感觉率达10%,而传统的抗病毒药物远期疗效均不显著,寻找新型抗HBV药物成为迫切需要。

  核酶(Ribozyme)是一类具有生物催化功能的RNA,可定点切割RNA靶分子,从而达到有效阻断基因表达的目的[1]。通过合理的设计及操作,核酶可阻断HBV的复制及表达。所以在基因治疗领域倍受重视。

  1 核酶的类型及设计

  到目前为止,人们发现的核酶共有六种类型。即Ⅰ类内含子、RNaseP、锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎核酶和VS核酶。通过对这六类核酶组成及结构的研究,人们已经开始利用锤头状、发夹状核酶的特点,人工合成所需要的核酶。Weizsacker[2]、汤华[3]。竺来发等人[4]所设计针对HBV的核酶,均采用这种传统方式。Hselh等[5]则就HDV核酶研究对乙型肝炎病毒的阻断作用。对于核酶的合成,有两种方法。①是用DNA/RNA合成仪直接合成。②先合成核酶的双链或单链模板,然后用T4DNA连接酶将其整合并克隆至合适的表达载体,让其表达出核酶。这是一种简单、实用的方法。通过对这些核酶的深入研究,有助于有效控制HBV的感染。

  2 提高核酶的稳定性

  由于血清和细胞内含有大量的核酸酶,体内表达核酶存在被降解的可能。因此目前大多数研究致力于提高体外合成核酶的稳定性修饰,也有关于体内表达核酶的稳定性的研究报道。在体外许多研究针对2’-OH进行修饰,以增加核酶的稳定性。如Taylor设计的DNA-RNA杂合核酶,即与底物配部分用脱氧核苷酸替代。结果其体外活性提高6倍,稳定性提高2倍。Heidenreich则以2’-氟替代,发现提高了稳定性但也降低了剪切活性[6]。亦有以2’-甲基,2’-脱氨,2’-氨基,磷硫替代等修饰的报道。

  核酶在细胞内提高稳定性则通过装在tRNA反密码环或在核酶末端引入茎环结构来进行。连建奇在核酶两端设计顺式核酶也是一种有效的方法[7]。

  3 提高抗病毒效率的方法

  ①体外进化 目前用的核酶,均为人工设计,但即使合理设计的核酶,催化效率也低于天然核酶。根据RNA分子进行技术提出进行体外筛选方法,在抗HIV中已有报道,对抗HBV也是一种可行的方法。②多位点核酶的联合作用,针对靶RNA分子的不同位点进行多位点破坏,进一步提高核酶的剪切率,这样既可防止HBV的变异引起变异逃避,也可减少空间构型的影响。许多设计都采用了这种思路,如Weizsacker所用三个核酶的串联作用。③与定向技术相结合,如用HBV外膜蛋白包装含有HDV核酶的弱毒株,可使其定向作用于靶器官肝脏。日本学者山田修平设计抗HCV的核酶时,使用唾液粘蛋白定向等等。④核酶与反义技术相结合。核酶与RNA诱饵(decoy)相结合,这种方法在抗HIV核酶中已有许多研究,如Homman等人的报道,抑制效率可提高4~7倍[8]。

  4 目前的研究现状

  抗HBV核酶的研究是核酶应用研究的一个热点。竺来发等人设计针对HBcAgmRNA编码序列的核酶。在Mg++存在下,将137nt的核酸准确地水解得到97nt和40nt两个片段,可有效地剪切HBV的mRNA。王平等人针对HBV的前c/c基因设计了锤头状核酶,经体外转录后可定点切割靶RNA[9]。同时在HepG2细胞中亦可显著抑制HBeAg、HBsAg的表达。Weizsacker构建了串联的核酶,分别针对HBV2029、2044、2049位点,结果表明三个核酶同时具有剪切作用,Beck设计也针对HBV包装点的锤头状核酶,体外剪切靶RNA,用U6snRNA表达核酶与HBV共转染,也可有将效切割RN[10]。Hsieh则将丁型肝炎核酶改造,利用外膜为HBsAg的特点。可将抗HBV的核酶靶向导入肝细胞中,为乙型肝炎治疗提供了一条新途径。Welch使用三个发夹状核酶,在Huh7细胞中与HBV共表达,使其表达下降66%,对核酶修饰后,则抑制率达83%。真核细胞表达的成功,预示对HBV基因治疗是可行的[11]。

  5 存在问题及展望

  抗HBV核酶的体外、体内的应用研究已取得了很大进展,但目前还有诸多问题问题尚待解决,如怎样选择敏感的靶位点,如何使核酶进入细胞,如何提高核酶的稳定性等。但就技术本身的发展潜力巨大。从已经进行的抗HIV核酶Ⅰ期临床实验中,我们已经看到了抗HBV核酶发展的曙光。

  参考文献

  1 Kruger k,Grabowski PJ,Zaug AJ,et al.Selfsplicing RNA:Autoexcision and autocy clixation of the ribosomal RNA intervening sequence of tetrahymena.Cell,1982,31:147.

  2 Weizsacker f,Blum H,Wands JR,Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA template.Biochem Biophys Res commun,1995,214(1):36.

  3 汤华,闻玉梅,何丽芳。核酶的体外合成及其对鸭乙型肝炎病毒S基因体外转录物的定点切割。病毒嘡报,1994,10(4):307。

  4 竺来发,易荣大,陆长德,等。乙型肝炎病毒adr亚型核心抗原RNA片段的体外ribozyme定点切割。生物化学与生物物理学报,1993,25(3):313。

  5 Hsieh sY,Taylar J.Delta virus as a vecter for the delivery of biologically-active RNAs possibaly a ribozyme specific for chronic hepatitis B virus infection.Adv Exp med Biol,1992,312:125

  6 Hiedenreich o.Eckstain F.Hammerhead ribozyme mediated cleavage of the long termmal repear rNA of human immunodeficiency virus type 1.J Biol chem.,1992,267(3):1904

  7 连建奇,周永兴,金由辛。抗HBV c区基因核酶自剪切转录载体的构建。第四军医大学学报,1997,18(4),371。

作者: 李谨革 连建奇 2004-9-27
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