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沙眼衣原体实验诊断技术进展

来源:论文汇编
摘要:随着检测技术的进展,Ct感染的诊断也不断地发生变化。一、细胞生物学检测方法1。组织细胞培养法是诊断Ct感染的“金标准”[4],但是由于分离培养操作复杂,技术及设备要求高,所需时间长,且敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大[5],加上国内很多医院不具备细胞培养条件,因而不适于临床应用,多用于科研和疑难......

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  1907年,捷克学者Halberstaeder和Prowazek发现沙眼包涵体,1956年我国学者汤飞凡等分离沙眼衣原体成功,引起了全世界对其进行广泛深入的研究[1]。沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, Ct)与人类疾病关系密切,且目前已成为许多国家和地区常见的性传播疾病病原体,日益引起人们重视。Ct感染的诊断决定于病原学检查。随着检测技术的进展,Ct感染的诊断也不断地发生变化。我们就此领域的研究进展作一简述。

  一、细胞生物学检测方法

  1.涂片镜检:Ct寄生于柱状上皮细胞内形成包涵体,取宫颈或尿道标本涂片后,通过碘染色或姬姆萨染色等可见细胞内包涵体。但由于泌尿生殖道中完整细胞较少,以及细胞内包涵体脆性较大,从而造成敏感性过低,不推荐用于临床标本的检查,仅限于Ct的鉴定[2]。

  2.细胞分离培养法:由于Ct的专性细胞寄生性,一般培养法不能使其生长,只有在活的细胞内才能增殖、复制。组织细胞培养法分离Ct多采用McCoy细胞或 Hela-229细胞(国内也有报道采用Hep-2细胞),染色后在显微镜下观察细胞内有无包涵体。早期曾试图用尿标本做培养,但阳性率甚低[3],只能采用尿道或宫颈拭子。培养法的特异性为100%,但敏感性一般低于100%,且各个实验室操作步骤有所不同,没有标准化,这可能有助于解释对同一种非培养方法的不同评价。组织细胞培养法是诊断Ct感染的“金标准”[4],但是由于分离培养操作复杂,技术及设备要求高,所需时间长,且敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大[5],加上国内很多医院不具备细胞培养条件,因而不适于临床应用,多用于科研和疑难病例的终鉴定。

  二、免疫学检测方法

  1.直接荧光抗体测定(DFA):将针对Ct的单克隆抗体用荧光标记,与标本中的Ct结合后,荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体(Ebs)。针对脂多糖(LPS)的抗体荧光不够亮,且染色不匀;而针对主要外膜蛋白(MOMP)的抗体荧光更亮,且减少非特异染色[6]。DFA不象培养法必须存在有活力的Ct,但其敏感性受人群感染率的影响,且有判定结果带有主观性,荧光易淬灭,不适于检测大量标本等缺点。多数学者报道其特异性较高,Hallsworth等[7]报道可达100%,因此在科研中常被用作确证试验。由于此法操作简便、费用低廉,在不具备分子生物学试验条件的医院,可用以检测临床标本[8],但也需经验丰富者操作。

  2.酶免疫测定(EIA):用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测Ct的LPS或MOMP,酶反应生成有色产物,用酶标仪进行测定。目前有Chlamydiazyme、ID-EIA、Pharmacia Chlamydia EIA等多种市售诊断试剂盒可供使用。其敏感性从64%到98%,特异性从93%到98%[9]。通常认为,其敏感性在高危人群中可得到满意结果,而在新近感染及治疗监测中敏感性明显下降。EIA的优点在于方法简便、操作自动化,适于短时内大批量标本的检测。但其最大缺点在于,与其他常见微生物产生交叉反应,如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌,从而使特异性达不到100%。国外此法多用于高危人群的筛查,国内应用较少。

  三、分子生物学检测方法

  1.直接检测核酸的技术(即基因探针技术):此技术利用核酸分子的复性原理,用特定的标记探针去检测标本中的靶核酸。最初为放射性标记,后来逐渐发展为酶或化学发光试剂标记。目前有美国圣地亚哥Gen-Probe公司生产的发光标记基因探针试剂盒PACE-2。与培养法相比,Gen-Probe方法的敏感性和特异性分别为73%~96%和98%~99%[9],尚无培养法敏感和特异。由于此法成本高、步骤繁琐,随着核酸扩增技术的出现,基因探针技术也就失去了其应用价值。

  2.核酸扩增技术:继基因探针技术之后,很快出现了核酸扩增技术,这些技术包括(1)靶DNA或RNA的扩增,如聚合酶链反应(PCR),基于转录的扩增(TBA),自动维持序列扩增(3SR) 以及链置换扩增(SDA);(2)探针扩增,如连接酶链反应(LCR),Q-β复制酶的扩增;(3)杂交后信号的扩增,如复合探针和分支DNA探针。其中研究和使用较多的是PCR和LCR,尤其是PCR技术,有学者认为其将对感染诊断引起革命性变化[10]。

  PCR属于一种核酸体外扩增技术,用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR每个循环包含变性、退火、延伸3个步骤,在不到2小时内,经过30个循环,在理论上可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA。由于先将标本中的核酸特异成分先行扩增复制再行检出,其敏感性较直接检测核酸大大提高。

  目前国内外用于构建引物的衣原体DNA有7.5Kb质粒、MOMP基因(omp1)和16SrRNA基因。诊断试剂盒AMPLICOR Ct PCR已通过食品与药品管理局(FDA)的审批,其扩增靶序列即为质粒DNA。许多研究都已表明,PCR较培养法和EIA法都要敏感[7,9,11],而且PCR对于有症状或无症状人群同样敏感[3]。但基于不同引物的PCR的敏感性仍有所不同。Roosendaal等[12]的研究表明,质粒引物PCR最敏感,omp1引物PCR最不敏感,16SrRNA基因引物PCR介于两者之间。这可解释为在每个衣原体细胞中DNA拷贝数不同的缘故。虽然omp1引物PCR敏感性较质粒PCR为差,但omp1引物PCR扩增的特异性好,而且Palmer等[13]报道通过巢式PCR,经过2轮扩增,同样能够达到质粒引物PCR的敏感性。并且omp1扩增后,利用限制性片段长度多态性(RFLP)还可对Ct进行基因分型[14],这对流行病学调查具有重要意义。

  PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本,而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物,从而影响PCR的敏感性。Verkooyen等[15]报道将标本进行预先的加热处理或使用2SP转运培养基可显著降低AMPLICOR Ct PCR对抑制因子的易感性。将临床标本加热处理后10倍稀释亦可在很大程度上防止这种抑制。除了尿中的抑制物会影响PCR的敏感性,导致出现假阴性结果外,PCR的另外一个缺点是由于其本身技术原理的原因,容易造成假阳性污染。

  近年亦有学者应用LCR检测Ct。LCR属于一种探针扩增技术,是依赖靶核酸序列的寡核苷酸探针的连接技术。Abbott LCR-CT诊断试剂盒也已通过FDA的审批。同PCR相比,由于使用两对引物,用LCR检测Ct感染,具有更高的敏感性和特异性[16]。但连接酶价格昂贵,难以在临床普及应用,仅适用于科研,且国内应用较少。

  最新发展的扩增试验是Gen-Probe公司的扩增Ct的转录介导扩增试验(TMA),扩增并检测Ct的rRNA。TMA的一个优点是每个感染细胞中有大量的rRNA。而且操作步骤简便,只是一个恒温过程,不需要变换温度的扩增仪。Crotchfelt等[17]报道TMA检测女性尿标本的敏感性和特异性分别为93.8%和100%,男性尿标本为95.6%和98.7%,提示TMA将成为另外一种能利用尿标本检测Ct的扩增方法。国内尚无采用该法进行检测的报道。

  目前除了发展各种核酸扩增技术,国外学者们又将眼光投向了标本取材方面的改进上。除尿标本外,外阴标本也可能作为一种非侵入性标本而适用于PCR、LCR和TMA等高度敏感的扩增方法,在筛查高危人群中可能会替代侵入性标本[18]。测试外阴涂片标本可以节省用于尿标本离心的时间,而且可以由患者自行取材[19]。另外,为节省时间和费用,有学者尝试,同时进行几种性传播疾病病原体的共同扩增,但结果不尽如人意[20-22]。

  综上所述,结合国内情况,泌尿生殖道Ct感染的实验诊断中,经典的细胞培养方法虽然特异,但耗时长、费用大,且不够敏感,不适于临床开展;免疫学方法简便快捷,在基层医院具有实用性;在具备分子生物学实验条件的医院,由于PCR方法高度敏感特异,可检测各发病率人群,只要严格规范操作,避免假阴性及假阳性结果的出现,可望在Ct感染诊断中常规使用。总之,Ct感染的诊断目前已发展到分子生物学水平,随着科学技术的不断进步,下个世纪有可能利用生物芯片等更新的技术进行检测。我们应密切注视检测技术的发展,以便准确、快速地对Ct感染作出诊断。

  作者单位:100044 北京医科大学人民医院检验

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作者: 自动采集 2005-1-1
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