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减少内源性核糖核酸酶对逆转录聚合酶链反应的影响

来源:论文汇编
摘要:在对人体组织细胞基因表达进行分析时,RNA的迅速降解是重要的影响因素。组织一旦从正常生存环境中分离,其中的RNA合成和降解的相对速率就发生改变,这不仅引起组织细胞中各种RNA相对含量发生变化,也导致整个RNA浓度的降低。组织标本被收集后,现已有一些方法可用于阻止组织中RNA浓度的降低。外源性的核糖核酸酶(RNase)污......

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  在对人体组织细胞基因表达进行分析时,RNA的迅速降解是重要的影响因素。组织一旦从正常生存环境中分离,其中的RNA合成和降解的相对速率就发生改变,这不仅引起组织细胞中各种RNA相对含量发生变化,也导致整个RNA浓度的降低。

  组织标本被收集后,现已有一些方法可用于阻止组织中RNA浓度的降低。外源性的核糖核酸酶(RNase)污染,特别是用RNase处理提取DNA时,通常是RNA丢失的一个重要原因。防止这种污染对保护RNA降解是绝对必需的,但对所有的RNA项目分析却是不够的。提取RNA时,常用RNase抑制剂如焦碳酸二乙酯(DEPC),或离液剂如氯化胍或异硫氰酸胍。这些抑制剂常结合使用,其对防止RNA降解是有益的,但是费时费力。用中性甲醛缓冲液快速固定组织标本或用乙醇等,破坏RNase活性,不仅增加了RNA分离的复杂性,还可能抑制逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测中的聚合酶的活性。

  为了减少分析RNA的时间和RNA提取、纯化导致的分析结果差异,一些学者提出无需RNA提取分离的RT-PCR技术,使RNA降解发生的时间大大缩短。然而许多实验室还未成功地采用这些方法,以RNA提取为基础的分析系统仍然是分子医学检验的主流。

  Hamalainen等通过实验显示,检测微小残留慢性骨髓性白血病分析时,一种潜在的RNase——嗜酸性细胞中的神经毒素是降低RT-PCR敏感性的主要因素。通过用单克隆抗体或密度梯度分离除去嗜酸性细胞,可显著增加无需RNA分离的RT-PCR的信号。与用细胞裂解或分离RNA的RT-PCR技术检测费城染色体(bcr/abl易位)方法相比,该法可能更快速、敏感和有更好的重现性。如果这种方法能广泛应用,它将呈现一种明显的进步。

  嗜酸性细胞中的神经毒素是RNase A超级家族中的一员,这个家族基因位于人类第14号染色体q24~q31区域,编码许多密切相关的非分泌型RNase。这些基因各包括两个外显子:一个单一内含子将一个非编码外显子1与外显子2的编码序列分开。这些基因的产物蛋白质有相同的活性位点残基和几乎相同的二级结构。嗜酸性细胞中的神经毒素(RNase2)仅在吞噬细胞中表达,包括中性粒细胞、大颗粒的嗜酸性细胞和单核细胞。

  其他一些相似的内源性非分泌型的RNase使得人类组织的分子生物学研究复杂化。RNase1几乎在所有健康人类组织都有表达。相反,第二种嗜酸性细胞RNase——嗜酸性细胞阳离子蛋白(RNase3)仅存在于嗜酸性细胞。RNase4存在于人类一些体细胞组织,包括肝、胰、肺、骨骼肌、肾脏和胎盘,但不存在于脑中。RNase4或一个抗原相似蛋白,也存在于血清。参与血管生成的RNase——血管生成素,有一相似的组织分布。RNase6位于健康人的单核细胞和中性粒细胞,但嗜酸性细胞中没有。RNase A超级家族所有成员很可能都来源于单一原始的RNase基因的复制。

  尽管它们二级结构有很高的同源性和相似的氨基酸活性位点,这些RNase的功能却不同。例如,血管生成素除了血管生成作用,还特异地降解t-RNA,而不降解m-RNA。嗜酸性细胞阳离子蛋白的RNase活性还不到嗜酸性细胞神经毒素RNase活性的1%。因为各种RNase的相对浓度在不同组织中不同,通过化学或物理方法除去单一酶或组织成分的分析对RT-PCR试验的影响很难估计。

  Hamalainen等的实验还显示,通过提取总RNA的RT-PCR,可将bcr/abl易位的检出率提高理论最小值的4倍,用物理方法除去嗜酸性细胞的RT-PCR试验与总RNA的RT-PCR相比可提高3倍检出率,用Ficoll-Hypaque的密度梯度去除则可提高约2倍检出率。当然,即使除去嗜酸性细胞,一些RNase活性的升高仍可能来自存在的RNase1和RNase4~6。

  去除嗜酸性细胞后检出率的显著提高,说明分子检测应注重组织中的细胞和分子成分在实验中的作用(包括污染作用),尽管该方法不可能去除RT-PCR分析测定中所有的RNase,但一些富含RNase的细胞成分(如嗜酸性细胞)可用物理的方法从待分析的组织细胞中分离。Hamalainen等除了提出技术框架外,实验中冰冻部分的显微解剖对一些标本的处理也是有益的。另外,通过分析实验系统中的测定结果,为优化非特异RNase抑制剂(如DEPC)的浓度提供可能。总之,设计特异的RNase抑制剂(如抗-RNase单克隆抗体),在细胞裂解中或裂解后加入以减少RNase的影响,将比现在应用的非特异抑制剂效果显著。通过努力减少内源性RNase对RNA分析的影响,在提高敏感性和重复性上,比采用过细的实验技术以减少外源污染时得到的结果更好。

                                             崔杰峰译 潘柏申校

作者: 自动采集 2005-1-1
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