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多重聚合酶链反应检测肾移植术后的微嵌合现象

来源:论文汇编
摘要:关于微嵌合和免疫耐受之间的关系,人们一直有着不同的看法。本试验选择女性患者,供肾者则为男性,故检测女性患者外周血细胞中男性特有的SRY基因,作为微嵌合的指标。并对89例肾移植术后受者外周血的微嵌合现象进行研究分析。标本收集:1993~1998年住本院的89例接受男性供肾的女性肾移植受者及1例女性供肾的女性肾移植受......

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  关于微嵌合和免疫耐受之间的关系,人们一直有着不同的看法。本试验选择女性患者,供肾者则为男性,故检测女性患者外周血细胞中男性特有的SRY基因,作为微嵌合的指标;并对89例肾移植术后受者外周血的微嵌合现象进行研究分析。报告如下:

  一、材料和方法

  1.标本收集:1993~1998年住本院的89例接受男性供肾的女性肾移植受者及1例女性供肾的女性肾移植受者,于术后不同时间取外周血2 ml(2%依地酸抗凝)。

  2.根据Gubbay等在1990年发现的人性别决定基因(SRY)序列设计引物对A(2701/2001):2701-5′CTAAGTATCAGTGTGAAACGGG3′;2001-5′CCTTCCGACGAGGTCGAT-AC3′。扩增片段280 bp为男性所特有。根据Nakabori的报告,在X-Y染色体部分同源区序列设计引物对C(AM/MI):AM-5′TGGTTGGCCTCAAGCCTGGT3′;MI-5′CCTTGCTCATTATAT-CTTGACAA3′。作为试验内对照,女性出现1条590 bp带;男性除590 bp带外,还出现1条355 bp带。

  3.480型PCR扩增仪;ABI373A-01型DNA自动测序仪及测序试剂盒购于美国PE公司。DNA自动测序仪使用按PE用户手册推荐方法进行操作。

  4.多重聚合酶链反应(PCR)技术:采用盐析法抽提DNA。扩增反应体系为20 μl,其中引物对A、引物对C各15 μmol/L;PCR循环条件为94℃ 1 min,60℃ 1 min,71℃1 min45个循环,71℃延伸10 min。扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。有280 bp扩增带者判定即有嵌合发生。

  5.多重PCR方法的灵敏度试验:采用分光光度法测定正常男性、女性DNA含量。将DNA浓度调至0.1 μg/μl。将男性DNA用女性DNA按1∶1、1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106比例稀释后取1 μl进行扩增。PCR产物用8%PAGE电泳分析。

  二、结果及讨论

  多重PCR灵敏度试验结果:标本均有作为内对照的590 bp扩增带,证明试验成功。引物对C扩增出Y染色体片段(355 bp)在1∶102存在,再稀释后则消失;引物对A扩增出SRY基因片段(280 bp)在稀释度为1∶104时,仍清晰可见。这是因为X-Y同源序列采用一对引物,相互竞争抑制所致,而扩增SRY基因的引物对,则基本上不受影响。此多重PCR对男性样品扩增的准确性起到双重保险作用。590、355、280 bp扩增带经373A-01型DNA自动测序仪检测,证实多重PCR结果为其相应的基因片段。该多重PCR操作简便,耗时短,是一种检测微嵌合的有效手段。

  女性供肾的女性受者结果:检测肾移植术后的病人中,有1例女性供肾的女性肾移植受者,其移植后几个月的外周血检测结果均显示出只有590 bp 1条扩增带,没有出现355 bp与280 bp带,证明此多重PCR法的特异性较高。

  89例男性供肾的女性受者检测结果:依照女性肾移植受者术后时间不同,将其分为半年以内组,6~18个月组,18个月以上组。其嵌合发生率分别为37.0%(10/27),51.5%(17/33),75.9%(22/29)。各组间嵌合发生率用χ2检验,P<0.05,其中18个月以上组与其他2组比较,差异亦有显著意义(P<0.05)。显示:随着生存时间的延长,微嵌合的发生率升高。

 

作者: 自动采集 2005-1-1
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