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细菌快速裂解方法研究

来源:论文汇编
摘要:16S-23SrRNA基因是位于16SrRNA基因与23SrRNA基因之间的区间序列,具有较好的保守性和相对的可变性,被认为是细菌鉴定的合适部位[1,2]。我们认为能否快速有效地扩增该区间,聚合酶链反应(PCR)扩增前的标本处理是关键。故比较了3种裂解细菌的方法。以上菌株由浙江省临床检验中心及结核病防治中心提供,保存于我院细菌......

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  16S-23S rRNA基因是位于16S rRNA基因与23S rRNA基因之间的区间序列,具有较好的保守性和相对的可变性,被认为是细菌鉴定的合适部位[1,2]。我们认为能否快速有效地扩增该区间,聚合酶链反应(PCR)扩增前的标本处理是关键。故比较了3种裂解细菌的方法。

  一、材料与方法

  1.菌株、人类基因组DNA及病毒株来源:革兰阳性6个菌种,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株;革兰阴性21个菌种,包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌等共40株。以上菌株由浙江省临床检验中心及结核病防治中心提供,保存于我院细菌室。人类基因组DNA、新型隐球菌、巨细胞病毒由本院中心实验室提供。

  2.临床标本:1999年6月~2000年3月本院新生儿住院患儿,部分为普通病房住院患儿。败血症血标本42份,脑脊液标本6份。对照组15份,为本院新生儿病房非感染患儿康复期待出院者的血标本。

  3.16S-23S rRNA基因区间序列引物设计:在细菌的16S rRNA基因的3′端及23S rRNA基因的5′端的保守序列内,经计算机软件查阅自行设计引物。

  4.临床标本处理:血标本:0.5 ml的肝素抗凝血置室温约10 min以沉淀血细胞,在血清与血细胞的交界面(即白细胞层)吸取200 μl,注入1.5 ml灭菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl 1 ml,摇匀,放入37℃水浴箱中。15 min后,取出,1 000 r/min离心5 min,去上清液,在沉淀物中加NH4Cl 1 ml,重复上述步骤2次。最后在沉淀物中加5% Chelex 100缓冲液(含0.03% SDS,1%吐温 20,1% NP 40 )200 μl和蛋白酶K 2 μl(20 mg/ml),56℃孵育60 min后煮沸15 min,稍加离心后,取上清液做PCR扩增。

  脑脊液标本:0.5 ml~1 ml脑脊液1 000 r/min离心1 min,去上清液,在沉淀物中加5% Chelex 100缓冲液200 μl和蛋白酶K 2 μl,56℃孵育 60 min后再煮沸15 min,稍加离心后,取上清液做PCR扩增。

  二、结果

  1.Chelex 100改良裂解法能裂解所研究的所有菌种,且扩增产物条带清晰,效果满意。用经典的酚氯仿抽提法扩增细菌,效果同Chelex 100改良法,但步骤繁琐[3]。

  2.临床标本的裂解:42例新生儿败血症血培养15例阳性,血标本经改良Chelex 100裂解,PCR扩增后27例阳性,其阳性率明显高于血培养,差异有显著性意义(P<0.01)。血培养阳性的15例PCR检测均阳性,且检测结果与血培养一致。另1组单纯用水煮裂解,只有5份阳性。6份脑脊液培养2例阳性,脑脊液PCR检测4例阳性,培养阳性的2例与PCR结果相符。15份对照组血标本血培养及PCR检测均阴性。

  3.敏感性及引物特异性试验:取潘尼变形杆菌标准菌株放入1 ml的dd H2O中,用麦氏比浊法确定起始浓度为108 CFU ,用dd H2O 1∶10定量稀释,浓度范围为2.5×104~2.5×10-3CFU,取2 μl模板在50 μl的PCR体系中扩增,检测扩增下限。Chelex 100缓冲液裂解法得PCR的最小检出量为2.5 CFU/ml。本对引物只能扩增细菌,与人基因组DNA、新型隐球菌、巨细胞病毒无交叉反应,说明本对引物扩增细菌16s-23srRNA基因有较好的特异性。

  三、讨论

  本研究首次在Chelex 100的基础上进行改良,加上其他一些试剂配成一种适合不同菌种(包括葡萄球菌在内)PCR扩增的裂解液。并发现用Chelex 100改良法裂解细菌后所扩增的条带较明亮清晰,效果满意,可检测2.5 CFU/ml的细菌,敏感性比水煮法提高了100倍。用经典的酚/氯仿抽提细菌DNA再行PCR扩增,效果与Chelex 100改良法相同。但经典的方法步骤较繁琐,DNA经常从1管转移到另1管,且还要使用多种试剂,这都增加了PCR污染的可能性。故Chelex 100改良裂解法是一简便有效的方法,适合于不同菌株的扩增。

  总之,经标准菌株和临床标本的初步应用,证明本研究建立的用Chelex100 改良法一步扩增细菌的16S-23S rRNA基因区间具有准确、敏感、简便、快速的特点,若经大量临床标本的进一步证实,可成为一理想的诊断技术。

  基金项目:浙江省自然基金资助项目(398426)

  参考文献

  1,Roth A, Fischer M, Hamid ME, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol, 1998,36:139-147.

  2,傅君芬,洪文澜.16S-23S rRNA 区间序列——一种分型及鉴别细菌的新方法《国外医学》流行病. 传染病分册,1998,25:245-249.

  3,尚世强 ,洪文澜 ,俞惠民,等. 细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型. 中华医学检验杂志 ,1998,21:281-284.

 
  

作者: 自动采集 2005-1-1
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