医源世界
首页合作平台医学论文内科学论文消化病学

RT-PCR检测外周血中肝癌细胞的研究进展

来源:论文汇编
摘要:摘要应用RT-PCR技术检测外周血中肝癌细胞是近年发展起来的新方法,白蛋白mRNA和AFPmRNA为肝组织特异表达,通过检测这二个转录子作为肝癌细胞存在于外周血的标记,有助于判断肝癌的转移、复发。肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC。以下简称肝癌)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在肝切除术后和肝移植术后再发率仍......

点击显示 收起


  摘要 应用RT-PCR技术检测外周血中肝癌细胞是近年发展起来的新方法,白蛋白mRNA和AFP mRNA为肝组织特异表达,通过检测这二个转录子作为肝癌细胞存在于外周血的标记,有助于判断肝癌的转移、复发。本文综述了近年有关这方面的研究进展。

  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC.以下简称肝癌)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在肝切除术后和肝移植术后再发率仍达50%以上[1]。因此,多数学者认为在手术之前患者外周血中已存在肿瘤细胞或已发生微转移而影像学诊断又未发现;也有学者推测可能是手术过程导致了肝癌的细胞播散。肝癌细胞的血源性播散是肝癌肝外转移的主要方式,所以在治疗前检测外周血中是否存在肝癌细胞可能是患者肿瘤复发、转移和预后的重要指标。近年兴起的逆转录酶-聚合酶反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)具有敏感性高、特异性强的优点,使检测外周血中的少量癌细胞成为可能,国外学者已相继报道利用RT-PCR技术在多种实体瘤患者外周血中成功地找到肿瘤细胞[2]。本文集中对外周血中检测肝癌细胞的研究作一综述。

  1 原理和方法

  rT-PCR技术是以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,由人工合成引物介导生成cDNA第一链,以此再作为聚合酶链反应的模板,在Taq dNA聚合酶作用下,扩增产生大量特异DNA片段。检测外周血中肿瘤细胞的依据是:由于血浆中富有大量的RNA酶,一旦血浆中出现RNA即会被降解,故血浆中不会有游离的mRNA,因此通过RT-PCR技术检测到的mRNA显然来自外周血中完整的循环细胞,选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素。目前,由于缺乏肝癌特异表达的mRNA,因此,肝组织特异性表达的白蛋白mRNA和甲胎蛋白(α-Fetoprotein, aFP)mRNA被用于肝癌细胞的检测。

  rT-PCR技术检测外周血肝癌细胞的一般步骤如下[3,4,5]:①静脉取血去除红细胞,收集有核细胞用于提取总RNA,或用淋巴分离液密度梯度离心纯化有核细胞,癌细胞与单核细胞在同一密度层。②异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。③RT-PCR反应,分为一次PCR和套式PCR。④结果检测,简单方法是电泳分离染色观察扩增带;为增加试验的敏感性和特异性,更多学者采用分子杂交的方法确定阳性结果。

  2 外周血白蛋白mRNA的检测

  Carr等在1991年美国肝病研究协会第42届年会上首次报告利用RT-PCR技术检测白蛋白mRNA以确定外周血中的肝癌细胞,结果表明在17例晚期患者中16例阳性,其中6例肝移植术后外周血白蛋白mRNA水平降低甚至消失,而2例术后白蛋白mRNA水平不变的患者出现肿瘤复发。同时检测的6例健康对照、10例肝硬化患者及10例肝硬化行肝移植术的病人均为阴性[6]。Hillaire和黄智铭等也得到相似的结果,统计学分析表明白蛋白mRNA阳性率与肝癌的临床分期、肿瘤的转移、复发相关[3,7]。

  随着更多实验室开展外周血白蛋白mRNA的研究,越来越多的资料表明白蛋白mRNA作为肝癌患者外周血中癌细胞的标志是不适宜的,其表现在三个方面:首先,在良性肝病、健康对照人群发现不同程度的阳性检出率。Louha[5]、Chou[8]、 Matsumura[10]、Muller[9]、Wong[11]、Ng[12]等人的结果证实了这一点,他们分别在5例、6例、8例、26例、9例、3例健康对照的外周血中检测到白蛋白mRNA;同时,Muller[9]的结果还表明在慢性肝病组织阳性率为88%(22/25),急性肝病组织为94.7%(18/19)。其次,部分良性肝病患者切除术后外周血白蛋白mRNA呈阳性。 ijzermans[13]等对5例良性肝病患者切除前后分析表明,术前外周血中均无白蛋白mRNA转录,而术后24h内均阳性,作者认为白蛋白mRNA可能是由于手术操作导致正常肝细胞释放进入血液循环造成的。其三,外周血白蛋白mRNA阳性与肝癌患者临床资料不相关,无临床指导意义。Barbu[14]等将101例肝病患者依是否外周血中转录白蛋白mRNA分为二组,比较二组间肿瘤大小、个数、有无门静脉瘤栓及肝外转移等各项临床资料,统计学分析表明二组间无显著差异(注:二组患者的治疗方案无显著不同);随访一年两年组间的存活期也无显著差异。

  综上所述,利用蛋白mRNA作为外周血肝癌细胞存在的标记是有争议的,一些学者指出这种差异可能是由于各实验室所使用的方法及灵敏度不同造成的。我们比较了不同文献的方法,其灵敏度在不同实验室也有较大差异,导致在不同患者组中检出率也不相同,最后所得结论也就不可避免是相反的。同时,我们也注意到各作者进行灵敏度分析时所用的肝癌细胞(系)是不同的,这就更难精确比较不同作者的结果。因此,我们认为将实验室结果的差异归于灵敏度的不同值得进一步商讨。总结上述文献初步认为:利用白蛋白mRNA作为肝癌细胞存在于外周血的标记是不适宜的,因为在良性肝病和健康对照中检测到白蛋白mRNA,具体到是何种细胞转录了白蛋白mRNA,目前尚无有效的方法加以证明,较流行的看法有二种,其一认为可能是外周血白细胞在某种生理状态下的不合理转录,另一种观点认为可能来自肝细胞脱落进入外周血。

  3 外周血AFP mRNA检测

  AFP基因是另一个肝组织特异表达的基因。Matsmura等采用套式RT-PCR技术检测AFP mRNA,发现33例肝癌患者中17例阳性,其中肝外转移阳性率100%(6/6),无肝外转移组40.7%(11/27),慢性肝病组11.8%(2/17),肝硬化组15.4%(2/13),26例健康对照无一例阳性;与临床资料比较表明,外周血AFP mRNA的检出率与肿瘤大小、临床分期、血清AFP水平及有无转移密切相关[10]。Komeda[4]、Louha[5]和Wang[15]等得到与此相近的结果,他们在肝癌组的阳性检出率分别是36%(23/64)、33.3%(28/84)和59.6%(28/47),而在肝炎病人、继发性肝癌和健康对照组中均阴性。有区别的是,Wang[15]认为外周血AFP mRNA阳性率与肿瘤分期、大小、有无转移等之间无相关性。

  在定性PCR的基础上,Wong[11]等以HepG2细胞作为外参标准,对AFP mRNA和白蛋白mRNA进行半定量PCR研究,结果表明AFP mRNA在68例肝癌患者中13例阳性,,18例健康对照组中2例阳性;而白蛋白mRNA阳性分别是44例和9例。根据二者分辨率不同,确定正常值上限后,AFP mRNA阳性例数分别是6和0,而白蛋白mRNA分别是34和7例,表明AFP mRNA具有更好的特异性,2例患者的AFP mRNA水平高于正常值1000倍以上,也许如此高的值更真实反映外周血中的癌细胞数。

  为确定AFP mRNA是否能够作为肝癌复发的一个标志,Nambu[16]等对一组早期肝癌(Ⅰ期5例/Ⅱ期9例)进行24至50个月的追踪观察,发现患者外周血AFP mRNA阳性与肿瘤复发呈正相关,作者推测外周血AFP mRNA也许是肝癌在早期复发的一个标志,并且连续检测外周血AFP mRNA可以作为一个预后因子。

  总结上述多篇文章的结果发现,利用AFP mRNA作为标记检测外周血肝癌细胞具有较好的敏感性和特异性,仅在个别良性肝癌患者中存在AFP mRNA的转录,不排除在病理状态下及肝脏损伤治疗时正常肝细胞脱落进入血中。而AFP mRNA则在肝癌组表现了较高的阳性率,即使在无转移的肝癌组也一样,这也许是为什么无转移的患者在肝切除或移植术后仍有很高复发率的原因之一。虽然检测外周血AFP mRNA已表明较强的特异性,但其与临床已知预后因子的关系上,上述作者并未得出一致的意见,我们认为这可能与各位作者所选择的病例和样本大小等有一定关系,若加大分析的样本数,也许能得到一个较为确切的结果。

  与上述肯定观点相反,Kweou等结果表明,外周血AFP mRNA在肝癌组阳性率为54.2%(26/48),同时慢性肝病组50%(6/12),继发肝癌组62.5%(5/8),健康对照组26.7%(4/15),尽管作者未解释原因,但对AFP mRNA作为血源性播散的标记提出质疑[17]。

  4 小 结

  综上所述,应用RT-PCR技术检测外周血肝癌细胞的研究尚处于起步阶段,有必要对白蛋白mRNA和AFP mRNA进行更深入的研究。另一方面,由于二者均为组织特异性表达基因,而非肝癌细胞特异基因,因此,如何选择恰当的肿瘤标志性靶mRNA,提高特异性和检出率将是今后研究的焦点。随着研究的深入,此项技术有可能在肝癌的临床诊治中发挥着重要的作用。

  参考文献

  1 zhou XD, Tang ZY, Yu YQ, et al. J Cancer Res Clin Oncol, 1996;122:59-62

  2 ghossein RA, Rosal J. Cancer, 1996;78:10-16

  3 hilaire S, Barbu V, Boucher E, et al. Gastroenterology, 1994;106:239-242

  4 komeda T, Fukuda Y, Sando T, et al. Cancer, 1995;75:2214-2219

  5 louha M, Poussin K, Ganne N, et al. Hepatology, 1997;26:998-1005

  6 carr BI, Kar S. Hepatology, 1991;14:242A.

  7 黄智铭,袁世珍,朱兆华,等。中华内科杂志,1998;37:10-13

  8 chou HC, Shen JC, Huang GT, et al. Gastroenterology, 1994;107:630-631

  9 muller C, Petermann D, Pfeffel F, et al. Hepatology, 1997;25:896-899

  10 matsumura M, Niwa Y, Kato N, et al. Hepatology, 1994;20:1418-1424

  11 wong IH-N, Leung T, Ho S, et al. Br J Cancer, 1997;76:628-633

  12 ng LOL, Choo CK, Lee JMF, et al. Hepoatology, 1997;26:455A

  13 ijzermans JNM, Bac DJ, Niesters BGM. Hepatology, 1996;23:1708-1709

  14 barbu V, Bonnand AM, Hillaire S, et al. Hepatology, 1997;26:1171-1174

  15 wang HJ, Ryu KS, Hong SW, et al. Hepatology, 1997;26:224A

  16 nambu S, Yata Y, Higuchi K, et al. Hepatology, 1997;26:571A

  17 kweou YO, Yi CK, Choi YH, et al. Hepatology, 1997;26:545A

 

作者: 自动采集 2005-1-1
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具