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首页合作平台在线期刊中华医学研究杂志2004年第4卷第2期综述

蚯蚓活性成分与应用研究进展

来源:INTERNET
摘要:蚯蚓(earthworm或lumbricus)俗称地龙,又名曲蟮、肾蚕、虫蟮等,为环节动物门(Aneelida)寡毛纲(Oligochaeta)动物,其种类繁多,资源丰富,在我国入药已有四千多年历史,《本草纲目》称其“治大腹黄疸”,“治中风疾病”,“化为水,疗伤寒”等等。我国蚯蚓约有3000余种,供药用者仅有秉氏环毛蚓(Pheretimacarnos......

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   蚯蚓(earthworm或lumbricus)俗称地龙,又名曲蟮、肾蚕、虫蟮等,为环节动物门(Aneelida)寡毛纲(Oligochaeta)动物,其种类繁多,资源丰富,在我国入药已有四千多年历史,《本草纲目》称其“治大腹黄疸”,“治中风疾病”,“化为水,疗伤寒”等等。我国蚯蚓约有3000余种,供药用者仅有秉氏环毛蚓(Pheretima carnosa)、赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)、背暗异唇蚓(Allolobophora caliginosa)、直隶环毛蚓(Pheretima tschiliensis)和参环毛蚓(Pheretima aspergillium)5种 [1]中药“广地龙”就是主产于广东、广西等地的参环毛蚓全体经剖腹洗净、晒干或焙干后的制品,“土地龙”则是主产于河南、山东、江苏、福建、安徽等地的背暗异唇蚓的全体制品。

国内外学者对蚯蚓的有效成分和药理作用研究表明 [2] ,蚯蚓体内含有丰富的蛋白质、氨基酸和酶类,其中一种酶在pH8.0~8.2时能使蚯蚓溶解;此外,还含有蚯蚓解热碱(Lumbrofebrine)、蚯蚓素(Lumbritin)、蚯蚓毒素(Terrestro-lumbrolysin)、脂类、嘌呤、胆碱(choline)、磷脂、胍(Guaniˉdine)、亚油酸、多种维生素及微量元素,具有活血化瘀、溶栓降压、清热定惊、消炎止痛、平喘止咳、通经利尿等功效,中医临床可用于治疗支气管炎及支气管哮喘、中风半身不遂、高血压、伤寒、流行性腮腺炎、下肢溃疡、骨折及带状疱疹等疾患。自20世纪80年代初日本学者美原恒(Mihara H)教授从蚯蚓中提取得到具有极高活性的纤溶酶以来,国内外对蚯蚓的研究空前活跃,有关纤溶酶的研究更是成为热点,取得了较大的进展。本文就其有效成分及其药理活性的研究进展作一综述。

1 蚯蚓活性成分

1.1 蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE,又称蚓激酶) 大量实验证明,蚯蚓提取物具有强烈的直接溶解血栓和人纤维蛋白的活性,且提取、分离、纯化活性组分的难易程度随蚯蚓品种的不同会有很大不同。

Mihara H等 [3] 从粉正蚓(Lumbricus rubellus)中分离得到六种具有纤溶活性的组分,这些组分对热较稳定,含有丰富的天冬酰胺和天冬氨酸,很少的脯氨酸和赖氨酸。Sumi H等 [4] 从粉正蚓(Lumbricus rubellus)的自溶液中分离出三个对纤维蛋白或血栓具有强溶解活性的组分,其分子量分别为40kD、21kD和15kD。

程牛亮等 [5,6] 用0.01mol/L、pH7.8的磷酸盐缓冲液抽提,硫酸胺盐析及Sephadex G-75等3种柱层析方法从双胸蚓(Lumbricidae Bimostos)组织匀浆中分离得到分子量为29kD和36kD的两种纤溶组分,具有强烈的溶解纤维蛋白的作用,对家兔实验性血凝块也有明显的溶解作用。

Hrzenjak T等 [7] 从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)提取物中分离得到分子量为34kD(PⅠ)和23kD(PⅡ)的二种丝氨酸 肽酶,PⅠ活性高于PⅡ,前者浓度为10 5 ng/ml时能使纤凝块溶解时间缩短54%,浓度为10 3 ng/ml时则完全抑制静脉血的凝固。熊焱等[8] 以新鲜赤子爱胜蚓为原料,经保温抽提、乙醇沉淀、多种层析、电泳等分离纯化步骤得到一种纯度达95%,分子量为33kD的单肽链纤溶酶,该酶具有很强的溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为900U/mg蛋白,TAME法测得其2500U/mg蛋白。

何执中等 [9] 用提取、沉淀、凝胶层析和离子交换等方法从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)中得到了单组分酶,活力收率为粗酶粉的19.1%,具有极强的纤溶活性,其分子量为30kD,比活力达6667U/mg蛋白,在pH4~11及25℃~55℃内稳定。赵晓瑜等 [10] 从太平二号蚓(Eisenia foetida)匀浆也进一步提取获得了一组糖蛋白纤溶酶,含糖量为5%左右,分子量为16~33kD,富含Asp,而Met、Trp和Lys含量很少;1mg蚯蚓纤溶酶相当于250~300尿激酶单位。

胡文军等 [11] 采用加提取剂的匀浆盐析及超滤等方法从参环毛蚓(Pheretima aspergillum)中获得了一种分子量为22kD、活性和纯度均较高的单链蛋白纤溶酶。

吴容等 [12] 通过选择热变性、大豆胰蛋白酶抑制剂-Sepharose4B亲和层析技术从蚯蚓中分离纯化得到具有强烈纤溶活性的酶组分,经PAGE检定为单一谱带,分子量为32kD,属丝氨酸蛋白酶。

彭先凤等 [13] 用硫酸胺盐析、沉淀和PAGE制备电泳从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)纤溶酶粗品中分离纯化得到5种组分(Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ),在PAGE中均呈单一带。其中,组分Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ能将纤维蛋白原中αβγ链依次降解,对α链亲和力最大。组分Ⅹ不能降解34.5kD、40kD、24.5kD片段,组分Ⅰ对α链有较高亲和力而对γ链无降解作用。

毛孙忠等 [14] 以正蚓科双胸属蚯蚓(Lumbricus Bimastus)经组织匀浆、缓冲液抽提与选择性热变性,再经抑制剂1,6-己二胺(HD)偶联的Sepharose4B亲和层析及DEAE-Sepharose离子交换层析法分离得到具有强烈纤溶活性的酶组分(EFE-F 1,2 ,EFE-F 3 ),其中EFE-F 3 对合成底物S-2288(HD-Ile-Pro-Arg-PNA)和chromozym P(cb2-Gly-Pro-Arg-PNA)的K m 分别为0.01mmol/L和0.02mmol/L,HD的K i 为1mmol/L;该酶热稳定性强,能抗4mol/L脲。

徐建民 [15] 、姜东胜 [16] 等,用慈菇蛋白酶抑制剂-Sepharose4B亲和层析法,从蚯蚓丙酮粉组提取物中直接分离出9种具有较高活性和纯度的纤溶酶。林少琴等[17] 用牛血纤溶酶原-Sepharose4B亲和层析法,从太平Ⅱ蚓(Eisenia foetida)丙酮粉粗提物中分离纯化获得一种纤溶酶。该酶为糖蛋白,含糖量约为1.43%,分子量为30kD,具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的间接溶解纤维蛋白的双重作用,并对人血凝块有明显溶解作用。1%PMSF对酶有显著抑制作用,说明该酶为典型的丝氨酸蛋白酶类酶。

辽宁省微生物研究所和中国预防医学科学院病毒研究所从正蚓科双胸属蚯蚓(Lumbricus Bimastus)中提取获得具有纤溶活性的纯品蛋白P(30) [18] ,氨基酸序列测定末端24个氨基酸为VIGGTNASPGEFPWQLSQQRQSGS,正在进行深入的研究。

为探讨纤溶酶的适应性和扩大使用范围,国外学者还对纤溶酶的结构进行了部分修饰。Nakajima N等 [19] 利用人血白蛋白片段,对从蚯蚓Lumbricus rubellus中提取的6种蛋白酶中纤溶酶活性最强的一种进行了化学修饰。修饰后的酶失去了母酶的抗原性,并与人血清白蛋白片段结合形成沉淀,这种结合可以显著提高酶对大鼠血浆中蛋白酶抑制剂灭活作用的抵抗能力,且该酶不会诱导血小板凝集,能迅速溶解血栓素引起的全血血栓块。Ryu GH等 [20,21] 则将纤溶活性最强的蚓激酶固定于抗肿瘤药多尿烷(polyurethane)表面并研究其酶活性和抗栓活性,结果表明,与可溶性的蚓激酶活性相比,固定后的酶保留了34%的活性,且不受热灭活、降解和各种酶酸环境的影响而保持稳定,其最适合pH值上升了一个单位。

以上文献资料表明,蚯蚓体内的纤溶酶组分十分复杂,酶学性质也比较复杂。它不仅具有直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性,还具有激活纤溶酶原的类尿激酶活性 [22] ;不仅能溶解血栓、抑制血栓形成,而且还具有抗凝作用 [23] 。但它在pH4~10的范围内都很稳定,是一类热稳定性非常好的蛋白水解酶,50℃以下可以长久保持活性 [10] ;虽在人工胃液中极不稳定,在37℃保温1h,酶活性几乎全部丧失,但在人工胃液中加入一定离子强度的缓冲液后保温同样时间,酶活性几乎没有损伤。其干燥物在室温下密封保存5年未见失活 [24]

1.2 纤溶酶原激活剂 杨嘉树等 [24~27] 从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)体内分离出一种可体外激活纤溶酶原而间接降解纤维蛋白的蚓激酶(e-PA),纯化过程包括:粗品的盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水相互层析。该酶分子量为45kD,由2个亚基通过疏水相互作用维系在一起,SDS电泳显示大、小亚基的分子量分别是26kD和18kD,而质谱测得大、小亚基的分子量分别是24556.7和15546.6。对大、小亚基进行氨基酸组成分析,结果显示大亚基不含Lys,而小亚基不含Cys,单独的大亚基只有较弱的纤溶活性,单独的小亚基没有任何可见的纤溶活性,很可能小亚基是一个调节亚基,大亚基是催化亚基。氨基酸序列测定大亚基N端25个氨基酸为VIGGTNASPGEIPWQLSQQRQSGSW(即Val-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Ile-Pro-Trp-Glu-Leu-Ser-Gln-Gln-Arg-Gln-Ser-Gly-Ser-Trp…)。e-PA可以切割碱性氨基酸、小的中性氨基酸及Met的羧基端,同时e-PA确能将纤溶酶原切割为纤溶酶。这一结论提示e-PA可能会发展成为新型溶栓药物。e-PA还具有降解苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)和

作者: 马福家 徐晶鸿 孙 炜 2005-7-19
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