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首页合作平台在线期刊中华医学研究杂志2005年第5卷第2期论著

雌二醇在体外对大鼠腹腔巨噬细胞活性的影响

来源:INTERNET
摘要:【摘要】目的研究雌二醇(Estradiol,E)对大鼠腹腔巨噬细胞的免疫作用机制。方法以大鼠腹腔巨噬细胞为对象,采用吞噬中性红法及MTT法,观察不同剂量、不同时间雌激素处理后腹腔巨噬细胞的活性及吞噬功能的变化。结果剂量为10-4、10-6可引起腹腔巨噬细胞吞噬功能抑制,该作用在E处理后的4h、8h、20h均明显,随......

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    【摘要】 目的  研究雌二醇(Estradiol,E)对大鼠腹腔巨噬细胞的免疫作用机制。 方法  以大鼠腹腔巨噬细胞为对象,采用吞噬中性红法及MTT法,观察不同剂量、不同时间雌激素处理后腹腔巨噬细胞的活性及吞噬功能的变化。 结果  剂量为10 -4 、10 -6 可引起腹腔巨噬细胞吞噬功能抑制,该作用在E处理后的4h、8h、20h均明显,随时间延长,作用增加。剂量10 -8 可增强吞噬功能。 结论  E具有免疫增强和免疫抑制双重功效,并随时间、剂量大小有变化。

   

    Effects of estradiol on immunocompetence of peritoneal macrophages of rat in vitro

    Yuan Wendan,Yang Fang,Chen Jinrong

    Department of Pathophysiology,Binzhou Medical College,Shandong256603.
   
    【Abstract】 Objective To investigate the immunological function of estradiol in vitro.Methods The prolif-erative ability of peritoneal macrophage was determined byMTT;The phagocytosis of rat peritoneal macrophages was e-valuated by neatral red method.Results E could not only obviously decrease the macrophage phagocytosis,but also decrease the proliferative ability induced by10 -4 E and10 -6 E.10 -8 E could increase immunocompetence of peritoneal macrophages.Conclusion Estradiol have the ability to regulate up or down the immunity.Effects are determined by time and dose.

   

    雌二醇(Estradiol,E)是具有广泛调节作用激素之一,对免疫系统的影响颇受研究者的注目。临床观察,雌激素与一些自身免疫性疾病和乳腺癌肿瘤的发生有着较密切的关系 [1] ,以及用雌激素的替代疗法可治疗某些疾病等,这些都提示雌激素对免疫系统的维持和调节方面可能起着一定的作用。而且不同剂量雌激素的使用可引起不同的免疫反应。雌激素可影响一系列复合的免疫调节事件,其总的结果可抑制或增强免疫反应。巨噬细胞(macrophage,M)是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞,具有非特异性直接清除各种异物,杀伤病原体和肿瘤细胞的功能,并具有抗原提呈作用 [2] 。本实验选用大鼠腹腔巨噬细胞进一步研究在整体条件下雌激素对免疫功能的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料 动物:6周龄雄性Wistar大鼠,(购于本校实验动物中心)。材料:Estrogen为sigma公司生产;RPMI-1640(HyClone产品);MTT(Sigma产品);二甲基亚砜(DMSO,江苏洪声化工厂);可溶性淀粉(浙江菱湖化工试剂厂);中性红(上海试剂三厂);细胞溶解液:无水乙醇与0.1醋酸以1:1(Vol)混匀即成。酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司Mod-el550)。

    1.2 方法

    1.2.1 腹腔巨噬细胞的收集 大鼠腹腔注射2%的无菌淀粉15ml,第3天断头处死大鼠,用冰冷D-Hanks液10ml冲洗腹腔2次,合并冲洗液,离心,去上清,D-Hanks液洗涤3次后,用含10%FCS的RPMI-1640培养液调细胞浓度为2×10 6 /ml,经台盼蓝染色检查细胞活性>95%。

    1.2.2 E对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(中性红法) 将该上述细胞悬液加96孔板,每孔100μl。置37℃贴壁2h,去掉未贴壁细胞,用D-Hanks液洗3次后,分别于各孔加入E和RPMI-1640培养液,使E终浓度为10 -4 ,10 -6 ,10 -8 ,置37℃、5%CO 2 恒温箱分别孵育4h,8h,20h后,弃去上液,每孔加入中性红100μl,37℃作用30min后,用D-Hanks液洗3次,加100μl细胞溶解液,置4℃冰箱过夜,上酶联免疫测试仪于490nm处测各孔OD值。

    1.2.3 采用MTT比色法间接反映细胞的活性 含10%FBS的1640培养液调大鼠腹腔巨噬细胞浓度为1×10 6 /ml,经台盼蓝染色细胞活性>95%,D-hanks液洗3次,将细胞悬液加于96孔板,每孔190μl,6复孔,分别加1640培养液、10 -4 的E、10 -6 E、10 -8 E补足终体积200μl,置37℃,5%CO 2 恒温培养箱孵育20h后,加5mg/ml的MTT溶液20μl/孔,继续孵育4h,离心,去上清液,每孔加入二甲亚砜(DMSO)150μl,震荡混匀后,在ELISA检测仪490nm处测OD值。

    1.3 统计学处理 所有数据用ˉx±s表示,结果均用SPSS11.0软件LSD检验

    2 结果

    雌二醇对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表1。E 1 :10 -4 、E 2 :10 -6 与贴壁的巨噬细胞作用后,使巨噬细胞吞噬中性红的能力明显减弱,与对照组比较具有高度统计学意义(P<0.01)。E 3 :10 -8 使巨噬细胞吞噬中性红的能力明显增强,与对照组比较具有高度统计学意义(P<0.01)。并均随时间延长作用增强,具有统计学意义(P<0.01)。

    表1 雌二醇对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(略)注:与空白组比较, * P<0.01;组间比较, △ P<0.01

    MTT比色法间接反映雌二醇对腹腔巨噬细胞的活性的影响结果见图1,E 1 :10 -4 、E 2 :10 -6 与贴壁的巨噬细胞作用后,巨噬细胞的活性明显减弱,与对照组比较具有高度统计学意义(P<0.01)。E 3 :10 -8 作用后巨噬细胞活性明显增强,与对照组比较具有高度统计学意义(P<0.01)。并均随时间延长作用增强,具有统计学意义(P<0.01)。

    图1 MTT比色法间接反映雌二醇对腹腔巨噬细胞的活性的影响(OD)

    3 讨论

    近年来内分泌免疫调节日益受到重视,其中雌二醇(Estradiol,E)是具有广泛调节作用激素之一,对免疫系统的影响颇受研究者的注目 [3] ,雌激素直接作用于淋巴细胞,抑制机体的免疫功能。Guthrie [4] 等观察到雌猪在排卵早期卵巢颗粒细胞发生程序性死亡与闭锁卵泡内雌二醇产物减少有关。张修武等发现雌二醇能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生典型的细胞程序性死亡的形态学改变和特征性的DNA“梯形”结构,是由雌激素直接作用于巨噬细胞的雌激素受体而启动,与蛋白激酶C的激活、合成新的蛋白质有关 [5] 。凋亡无疑会影响巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和吞噬体内自然凋亡的淋巴细胞产生的核小体的能力,被认为与肿瘤及自身免疫性疾病的发生有密切关系 [6,7] 。巨噬细胞是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞,具有非特异性直接清除各种异物,杀伤病原体和肿瘤细胞的功能 [8] 。本实验选用腹腔巨噬细胞体外吞噬中性红的方法来观察E对巨噬细胞的影响。噻唑盐(MTT)比色实验是检测细胞存活和生长的方法。活细胞线粒体中的乳酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中,线粒体膜损伤时,MTT被还原量明显减少,而死细胞则无此功能。二甲亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可直接反映细胞的代谢活性,间接反映活细胞数量。它的特点是灵敏度高、重复性好、操作简便、经济快速、无放射性污染,与其他检测 细胞活力的方法(如3H TdR掺入实验等)有良好的相关性,因而广泛应用于检测细胞活性、抗癌药物对肿瘤增殖活性的效应和抗癌药物筛选等研究。本实验采用MTT方法,间接反映雌二醇对腹腔巨噬细胞的活性的影响。结果可见,10 -4 浓度的E可显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,并随时间延长作用明显。10 -6 E在20h时抑制作用表现明显。考虑大剂量E快速引起巨噬细胞凋亡而小剂量则凋亡过程出现较晚。10 -8 E可显著增强细胞吞噬功能,促进细胞增殖。被抑制的巨噬细胞胞体小,细胞活性低,吞噬功能弱。当巨噬细胞活跃时,细胞胞体变大、表面突起增多,细胞吞噬功能增强。另有研究报道E可增强单核吞噬细胞系统功能,增强巨噬细胞的吞噬作用 [9] 。Maoz等在观察雌二醇对骨髓单核细胞集落形成的影响时,发现生理性雌二醇能使骨髓单核细胞集落数增加。高玉民等 [10] 研究发现向小鼠腹部注入20μg b-17雌二醇后,小鼠腹腔巨噬细胞数量增加,吞噬功能及形成EAC花环能力增强。本实验结果HE染色显示:10 -8 的E改善巨噬细胞吞噬功能,形态学观察发现,E处理的M细胞胞体变大、表面突起增多,细胞伸展率提高。免疫调节的现代学说包括对于免疫系统的一系列复杂的正和负的影响,在评价雌激素作为免疫调节物的任何作用时,既要考虑到它对免疫网的一个个成分的作用,又要考虑到不同剂量所引起不同的免疫反应。雌激素可影响任何一种或一系列复合的调节事件,其总的结果可抑制或增强免疫反应。但作用机制仍有待于研究。

    参考文献

    1 Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Esposure of phos-phatidylserine on the surface of apoptosis lymphocytes triggers specific recognition and removeal by macrophages.J Immunol,1992,148:2216.

    2 Williams MA,Newland AC.The potential for monocyte mediated im-munotherapy during infection and malignancy.Part I:apoptosis induc-tion and cytotoxic mechanisms.Leuk Lymphoma,1999,Jun;34(1-2):1-23.

    3 郑飞武.医学免疫学.北京:人民卫生出版社,1989,166-169.

    4 Guthrie HD,Grimes RW,Cooper BS,et al.Folicular atresia in pigs:Measurement and physiology.J Anim Sci,1995,73(9):2834.

    5 张修武,牛喜林.雌二醇诱导小鼠腹腔巨噬细胞程序性死亡.免疫学杂志,1997,13(1):14.

    6 Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Esposure of phos-phatidylserine on the surface of apoptosis lymphocytes triggers specific recognition and removeal by macrophages.J Immunol,1992,148:2216.

7 Fadok VA,Savill JS,Haslett C,et al.Different populations ofmacrophages use either the vitronection receptor or the phosphatidylser-ine receptor to recognize and remove apoptosis cells.J Immunol,1992,149:4029.

    8 Williams MA,Newland AC.The potential for monocyte mediated im-munotherapy during infection and malignancy.Part I:apoptosis induc-tion and cytotoxic mechanisms.Leuk Lymphoma,1999,Jun;34(1-2): 1-23.

    9 Chao TC,van Alten PJ,Greaper JA,et al.Steroid sex hormones regulate the release of tumor necrosis factor by macrophages.Cell Immunol, 1995,160:43.

    10 高玉民.b-17雌二醇对小鼠腹腔巨噬细胞的影响.白求恩医科大学学报,1990,16(3):251.

   

    作者单位:256603山东滨洲医学院病生教研室
    山东聊城卫校

作者: 袁文丹 杨 芳 陈金荣 2005-7-26
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