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汉语阅读障碍儿童DYX1C1基因多态性研究

来源:《中国学校卫生》
摘要:【摘要】目的研究汉语阅读障碍儿童DYX1C1基因多态性特点,为从分子水平揭示阅读障碍的病因机制提供参考。方法采取病例-对照的方法,选取汉语阅读障碍儿童34名,非阅读障碍儿童(对照组)55名。收集儿童口腔上皮细胞提取基因组DNA,进行聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析DYX1C1基因第二外......

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【摘要】  目的 研究汉语阅读障碍儿童DYX1C1基因多态性特点,为从分子水平揭示阅读障碍的病因机制提供参考。方法 采取病例-对照的方法,选取汉语阅读障碍儿童34名,非阅读障碍儿童(对照组)55名。收集儿童口腔上皮细胞提取基因组DNA,进行聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点的多态性。结果 DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点,在阅读障碍儿童组中AA,AG,GG基因型频率分别为0,5.9%,94.1%,等位基因A和G的频率为2.9%和97.1%;在阅读能力正常儿童组的基因型频率分别为0(AA),12.7%(AG)和87.3%(GG),等位基因频率为6.4%(A)和93.6%(G)。该位点的基因型分布及其等位基因频率在阅读障碍儿童组与对照组之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点的任一突变基因型与发生阅读障碍的危险度无显著性升高(P>0.05)。结论 DYX1C1基因第二外显子-3位点的多态性可能不是影响汉语阅读障碍发生的遗传易感因素。

【关键词】  语言;阅读障碍;多态性,单核苷酸;儿童

【基金项目】  国家自然科学基金项目(编号:30471468,30600501)。

  DYX1C1 Gene Polymorphisms Among Chinese Children with Dyslexia/
 
  SONG Ranran, WU Hanrong.

  Department of Child & Adolescent Health and Maternal Care, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology,Wuhan (430030), China
   
  【Abstract】  Objective  To study the characters of DYX1C1 gene polymorphisms among Chinese children with dyslexia, and to provide reference for the cause of dyslexia. Methods  By using the method of casecontrol, 34 dyslexic children and 55 nondyslexic chileren were chosen. Children' s buccal cells were collected as a source of DNA for polymorphism analysis and allele specific analysis (ASA). The genotypes were tested by polymerase chain reaction following restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP).Results  In dyslexic group, the distribution of genotypes of the-3 position in the second extron of DYX1C1 was 0 for AA, 5.9% for AG and 94.1% for GG, and the alleles frequencies were 2.9% (A) and 97.1% (G). In the normal group, the distribution of genotypes was 0 (AA), 12.7% (AG) and 87.3% (GG), and the alleles frequencies were 6.4% (A) and 93.6% (G). There were no significant differences in the distribution of genotypes and alleles frequencies of the -3 position in the second extron of DYX1C1 gene between dylexic group and normal group (P>0.05).Conclusion  Genetic polymorphism of this position in DYX1C1 gene might not be the susceptible factor of Chinese dyslexia.
   
  【Key words】  Language; Dyslexia; Polymorphism, single nucletide; Child

  阅读障碍是一种特殊阅读能力受损状态。早在1905年,Thomas就发现阅读障碍具有明显家族聚集性,随后的大量研究证明了遗传因素在阅读中的重要性[1]。寻找直接影响阅读障碍的基因,已经成为当今研究的焦点问题。本研究拟采用病例对照的方法,应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分析DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点的多态性,初步探讨汉语阅读障碍儿童的遗传特点,旨在从分子水平揭示阅读障碍的病因机制。

  1  对象与方法

  1.1  对象  研究对象为武汉市某小学三~五年级89名学生,其中汉语阅读障碍儿童34名(男生23名,女生11名),平均年龄为(9.87±0.85)岁;对照组(阅读能力正常)55名儿童,平均年龄为(10.27±0.59)岁,其中女性29名,男性26名。两组之间年龄差异有统计学意义(t=2.40,P<0.05),性别差异无统计学意义(χ2=3.53,P>0.05)。参加本研究的儿童智商正常(智商≥80分),均为右利手,无视听觉障碍及器质性脑病。所有对象参加研究均取得本人及父母(监护人)的知情同意。阅读障碍儿童入选标准满足以下条件:(1)“儿童学习障碍筛查量表”[2](PRS)分数总分低于65分;(2)学习成绩位于后10%;(3)《儿童中文阅读能力检查表》[3-4]分数高于均分2个标准差;(4)采用龚耀先修订的“中国修订韦氏儿童智力量表”[5]进行智测,智商均在80分以上;(5)无视听觉障碍及器质性脑病。

  1.2  方法

  1.2.1  口腔上皮细胞收集和保存  选用0.9%的生理盐水40 mL,分3次给受试者漱口,每次漱口20~30次,以获得足量的口腔上皮细胞;用无菌试管采集受试者的漱口水,将漱口水样本倒入内有10 mL异丙醇的50 mL离心管内,3 000转/min,离心半径为13 cm,离心12 min,弃上清液,加入2 mL生理盐水,将沉淀打散,保存于-80℃冰箱。

  1.2.2  基因多态性分析

  1.2.2.1  DNA提取  采用标准酚-氯仿抽提法从口腔上皮细胞中提取基因组DNA。测定260 nm和280 nm光密度值,计算DNA浓度和纯度。

  1.2.2.2  基因分型  采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点的多态性。引物序列上游:5'-TGC TTA ACT GGC TGC TTC GTA CCG GCA GCT TCC CTA GCA ACC AAG-3';下游:5'-GAA CAC GTC CGT GTC TCT GA-3'。PCR扩增171bp目的片断:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,共36个循环;72℃延伸5 min。限制性内切酶Msp I 37℃消化PCR产物6 h,3%琼脂糖凝胶电泳观察结果。电泳图谱见图1。

  图1  DYX1C1基因PCR产物酶切示意图(略)

  1.3  统计分析  研究样本的群体代表性予以Hardy-Weiberg平衡检验确认;应用SPSS 12.0软件包进行统计分析,基因型频率和等位基因频率的组间比较采用χ2检验。

  2  结果

  2.1  DYX1C1基因多态性检测结果  如表1所示,DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点在阅读障碍儿童组中AA,AG,GG基因型频率分别为0,5.9%,94.1%,等位基因A和G的频率为2.9%和97.1%;在阅读能力正常儿童组的基因型频率分别为0(AA),12.7%(AG)和87.3%(GG),等位基因频率为6.4%(A)和93.6%(G)。该位点的基因型分布及其等位基因频率在阅读障碍组和对照组之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

  表1  DYX1C1在阅读障碍组儿童和对照组儿童之间的基因型分布和等位基因频率(略)

  注:()内数字为等位基因频率/%。

  2.2  不同基因型儿童发生阅读障碍的危险度  如表2所示,采用多元Logistic回归分析对2组间年龄进行校正后,未发现DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点的任一基因型发生阅读障碍的危险度有显著性升高(P值均>0.05)。

  表2  DYX1C1不同基因型发生阅读障碍的危险度(略)

  3  讨论
   
  遗传易感性研究所必需的基因组DNA一般都是来源于外周血白细胞。近年来,国外已有报道采用口腔脱落细胞提取DNA进行基因多态性研究[6],也有成功应用口腔细胞提取DNA进行的研究[7-8]。该方法无创伤,容易被儿童和家长接受,能够提供用于基因多态性分析的基因组DNA。本研究的位点位于DYX1C1基因,是近年来研究较多的基因之一[9]。
   
  本研究检测的DYX1C1基因第二外显子-3位单核苷酸位点为ELK-1转录因子结合位点。对其多态性进行分析后发现,基因型分布及其等位基因频率在阅读障碍儿童组和正常对照组之间较为接近,GG基因型占大多数,AG基因型较少,AA基因型非常稀有,2组间差异无统计学意义。采用多元Logistic回归对2组间年龄因素进行校正后,未发现任一基因型发生阅读障碍的危险度有显著性升高。提示DYX1C1基因第二外显子-3位点的多态性可能不是影响汉语阅读障碍发生的遗传易感因素。Taipale等[9]的研究发现,阅读障碍患者在DYX1C1基因的-3位点出现基因型的改变,即-3G→A,除此之外,还有1249G→T的点突变,认为DYX1C1是阅读障碍的候选基因。一项英国较大规模的家系研究[10]否认了Taipale的观点,认为DYX1C基因可能不是阅读障碍的易感因素,等位基因A频率在2.5%~8.3%,与本研究结果类似。阅读障碍的遗传机制研究受人种、地域、语言、环境等多种因素影响。汉语属于表意文字体系,与表音文字的识别模式差异较大,且选择人群不同,可能是造成本次实验结果的原因之一。阅读障碍的发生受到环境和多种遗传因素的综合影响,单基因的某一个位点的作用有限,且所分析的位点位于非编码区,其他位点的研究有待尽快开展。同时,由于研究对象为在校儿童,样本数量偏少,进一步的研究应加大样本量,提高检验效能,根据人类单倍型计划所筛选的标记型SNPs,深入分析DYX1C1上的各个位点,筛选可能的易感性位点,并探索其与其他基因可能的交互作用。
   
  本次研究虽然没有发现该位点的多态性与汉语阅读障碍发生有关,但是成功利用采集儿童口腔细胞的方法进行基因组DNA提取以及PCR研究,为汉语阅读障碍的遗传机制研究开辟了新思路,提供了实验基础和经验,有利于进一步开展遗传因素的研究和科研工作。

【参考文献】
    [1] RLOW AJ, FISHER SE,RICHARDSON AJ, et al. Investigation of quantitative measures related to reading disability in a large sample of sibpairs from the UK. Behav Genet, 2001,31(2):219-230.

  [2] 静进,余淼,邓桂芬. 学习能力障碍筛查量表的修订和在小学生中的试用. 心理发展与教育, 1995(1):24-29.

  [3] 吴汉荣,宋然然,姚彬. 儿童汉语阅读障碍量表的信度效度分析. 中国学校卫生, 2006,27(6):468-469.

  [4] 吴汉荣,宋然然,姚彬. 儿童汉语阅读障碍量表的初步编制. 中国学校卫生, 2006,27(3):189-190.

  [5] 龚耀先,蔡太生. 中国修订韦氏儿童智力量表(C-WISC)手册. 长沙:湖南地图出版社,1993:12-40.

  [6] HEALTH EM, MORKEN NW,CAMPBELL KA, et al. Use of buccal cells collected in mouthwash as a source of DNA for clinical testing. Arch Pathol Lab Med, 2001,125(1):127-133.

  [7] 程家蓉,关赛芳,王学励,等. 人口腔细胞P450 、GST基因多态性研究. 肿瘤, 2002,22(3):242-245.

  [8] 何子红,马力宏. 由口腔上皮细胞提取核Fg 基因方法学的建立及其在运动医学中的应用. 中国运动医学杂志, 2001,20 (2):180-182.

  [9] TAIPALE M, KAMINEN N, NOPOLAHEMMI J, et al. A candidate gene for developmental dyslexia encodes a nuclear tetratricopeptide repeat domain protein dynamically regulated in brain. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(20):11 553-11 558.

  [10]SCERRI TS,FISHER SE,FRANCKS C, et al. Putative functional alleles of DYX1C1 are not associated with dyslexia susceptibility in a large sample of sibling pairs from the UK. J Med Genet, 2004, 41(11):853-857.


作者单位:华中科技大学同济医学院公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学系,湖北武汉 430030。

作者: 宋然然,吴汉荣
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