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首页合作平台在线期刊中华现代临床医学杂志2004年第2卷第11B期

猪苓菌丝发酵培养及其多糖的药用研究

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:猪苓属于担子菌纲,多孔菌属。猪苓渗湿利尿,入脾、肾、膀胱经,历来主治小便不利、水肿胀满、脚气、泄泻等症。近年来据报道猪苓水溶性提取物———多糖在抗肿瘤方面有显著效果。因此我们用发酵手段获得猪苓菌丝以扩大药源,从中提取多糖成分用于抗肿瘤,结果认为猪苓菌丝多糖是一种非特异性免疫刺激剂,它可以加强细胞免......

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  猪苓属于担子菌纲,多孔菌属。猪苓渗湿利尿,入脾、肾、膀胱经,历来主治小便不利、水肿胀满、脚气、泄泻等症。近年来据报道猪苓水溶性提取物———多糖在抗肿瘤方面有显著效果。因此我们用发酵手段获得猪苓菌丝以扩大药源,从中提取多糖成分用于抗肿瘤,结果认为猪苓菌丝多糖是一种非特异性免疫刺激剂,它可以加强细胞免疫和体液免疫功能。本文主要报告猪苓菌丝发酵培养,发酵条件的确定,猪苓菌丝多糖的提取以及药用研究。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

    1.1.1 菌株 猪苓菌F8601由本所分离所得。

    1.1.2 培养基及发酵条件 (1)斜面培养基及培养条件:淀粉3%:葡萄糖2%;蛋白胨2%;琼脂2%;pH7.0。温度26℃,培养5~7天。(2)摇瓶培养基及发酵条件:淀粉1.5%;葡萄糖2%;蛋白胨0.5%;MgSO 4 0.06%;(NH 4 ) 2 SO 4 0.3%;KH 2 PO 4 0.15%;K 2 HPO 4 0.15%;VB 1 1mg%,VB 6 1mg%;CaCO 3 0.2%,pH7.0。温度26℃,摇床转速:180~220rpm,装量:100ml/500ml瓶,接种量:1接种铲,时间:48h。(3)种子罐培养基及发酵条件:淀粉1.5%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;(NH 4 ) 2 SO 4 0.15%;KH 2 PO 4 0.15%;VB 11mg%;VB 6 1mg%;CaCO 3 0.2%;豆油0.3%:pH7.0。温度26℃,罐压0.3~0.5kg/cm 2 ,通气量:1∶0.5~1∶1,搅拌转速:400rpm,装量:50%~60%,接种量:0.5%~0.8%,时间:48~60h。(4)发酵罐培养基及发酵条件:淀粉1.5%:葡萄糖1.5%;蛋白胨1%;(NH 4 ) 2 SO 4 0.2%;KH 2 PO 4 0.15%;VB 1 1mg%;VB 6 1mg%;CaCO 3 0.2%;豆油0.3%;pH7.0。温度26℃,罐压0.3~0.5kg/cm 2 ,通气量:1∶0.5~1∶1,搅拌转速:400rpm,装量:50%~60%,接种量:15%~20%,时间:36~48h。

    1.2 操作方法 (1)培养过程:保藏菌种传斜面,经26℃培养5~7天接摇瓶,26℃培养2~3天进种子罐(接种量:0.5%~0.8%),26℃培养2~3天,再接发酵罐(接种量:15%~20%),26℃培养1~2天,放罐。(2)发酵后处理:用三角式离心机离心发酵液,菌丝于50℃~60℃烘干得到干品,滤液浓缩(5%~10%)。

    1.3 分析测定 (1)pH值:精密pH试纸。(2)糖、氮含量测定:测种子罐,发酵罐培养液中总糖,氨基氮的含量,每8h测1次。(3)显微镜观察:观察菌生长情况,发酵是否正常。(4)菌丝浓度测定:(发酵液-上清液
上清液 ×100%)(5)收率:(菌丝干重配料体积×100%)。

    1.4 猪苓菌丝多糖的提取 (1)提取方法:取猪苓干菌丝若干公斤,加入5倍量的蒸馏水,加温115.5℃提取3次,时间为1.5,1.0,0.5小时,合并3次提取液滤过。除去不溶性杂质,滤液减压浓缩,在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80%,静置12h,滤取析出物,低温干燥。将所得之干燥物溶于蒸馏水中,加热煮沸后,趁热滤除不溶物,滤液在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80%,静置24h,滤取析出物,用80%乙醇洗涤3次,低温干燥,即得粗多糖。(2)多糖的鉴别:①纸层析:用毛细管吸取粗品水溶液,点于新华层析纸上,用正丁醇:无水乙醇:水(3.5∶3∶3)展开,以氨制硝酸银试剂(0.1N硝酸银与5N氨水1∶1混合液)喷雾,于120℃烘烤5~10min,显褐色斑示多糖位置。②多糖确证实验:取粗品水溶液10ml,加入过量的碱性酒石铜试液,加温煮沸2min,将产生的红色沉淀滤除,滤液仍保持蓝色。取此滤液用硫酸酸化,加温煮沸水解10min后,用10%氢氧化钠溶液中和,再加入适量碱性酒石酸铜试剂,加温煮沸,产生砖红色氧化亚铜沉淀。以上结果表明:粗品除含多糖外,尚含蛋白质杂质。(3)多糖粗品的精制:将多糖粗品溶于一定体积的蒸馏水中,准确量取若干毫升,在搅拌下滴加1%鞣酸(药用规格)溶液,边加边升温,煮沸后离心弃去沉淀,至取上清液加入1滴鞣酸溶液不混浊止(注意勿使鞣酸过量),换算出粗品溶液所需加入鞣酸的量。操作时先将全量药液煮沸,在搅拌下缓缓加入鞣酸溶液,待反应完全后,继续煮 沸15min,加入2%的活性炭搅拌10min,用布氏漏斗脱炭滤过,滤液加入乙醇使含醇量达到70%,静置24h后,滤取析出物,用70%乙醇反复抽洗沉淀,至检查洗液中不含鞣酸止。将湿品溶于一定量的20%的热乙醇中,通过置于布氏漏斗中中性氧化铝层,微微减压后,使药液缓缓流出,继续加入60℃热蒸馏水洗脱,收集流出液,减压浓缩成一定体积,加入乙醇,使含醇量达到70%,放置即析出白色絮状沉淀,过滤收集沉淀,低温干燥,即得猪苓多糖纯品。

  2 结果

    2.1 猪苓菌丝的中试放大 为了验证小试数据,使猪苓菌丝能尽快实现工业化生产,我们在原先小试的基础上对猪苓菌丝培养进行了中试放大(二级发酵),成功地试验了10批(见表1),从而确定了猪苓菌丝发酵生产的最佳培养基配方及发酵条件,并且收得菌丝65kg左右,平均收率为1.26%。

    2.2 一级发酵罐(种子罐,体积100L)培养猪苓菌丝生长及糖、氮耗用情况 见表2。从表2可以看出:一级罐(种子罐)发酵前期,菌丝生长缓慢,糖、氮消耗慢,到发酵后期,菌丝大量生长,而且有孢子产生,糖、氮消耗速度加快,此时可考虑二级发酵罐培养。

    2.3 二级发酵罐(体积1000L)培养猪苓菌丝生长及糖、氮消耗情况 见表3。

  表1 猪苓菌丝二级发酵生产略

  表2 一级发酵罐(略)
  
  表3 二级发酵罐培养略

  从表3可以看出:二级发酵罐菌丝生长快,糖、氮消耗速度也加快,到培养后期,菌丝趋于老化,孢子大量,应及时考虑放罐,离心,收得菌丝。

    2.4 猪苓菌丝多糖的提取 (1)粗品的提取:取猪苓干菌丝10kg,加入50kg量的蒸馏水,按前面所述的提取方法水提3次,80%乙醇沉淀2次,低温干燥,最后提得多糖粗品1.2kg,收率为12%。(2)多糖的鉴别:样品:猪苓粗多糖,标准品:葡萄糖,用纸层析,多糖确证实验两种鉴别方法鉴别(方法同前)。从鉴别结果看:提得的粗多糖中杂质含量较高。(3)粗多糖的精制:按前面所述的精制方法,我们对提得的粗多糖进行了部分精制。称取菌丝粗多糖250g,加水溶解,过滤,去除不溶物,在搅拌下滴加1%鞣酸溶液去除蛋白质,加入2%的活性炭脱色,用布氏漏斗脱炭滤过,再用70%乙醇沉淀,滤取析出物,将湿品溶于400ml20%的热乙醇中,通过中性氧化铝柱,收集流出液,减压浓缩,加入乙醇(使含醇量达到70%),放置即析出白色絮状物,过滤收集沉淀,低温干燥,即得纯品50g,收率20%。

    3 讨论

  猪苓菌丝多糖具有抗肿瘤作用。我们用提得的猪苓菌 丝多糖对小鼠进行了肿瘤免疫实验 [1~3]  ,实验结果表明:猪苓菌丝水溶性提取物(多糖)对小鼠的网状内皮系统功能有明显的增强作用。而对小鼠的几种移植性肿瘤有明显的抑制作用。这说明猪苓菌丝多糖是一种非特异性免疫刺激剂,它可以加强细胞免疫和体液免疫功能。猪苓菌丝水溶性提取物(多糖成分)对小鼠肉瘤S 180  腹水癌细胞的增殖也具有明显的抑制作用。

    综上所述,通过对猪苓菌丝的中试放大,得出一整套适合猪苓菌丝发酵生产的最佳培养基配方及工艺条件。通过猪苓菌丝多糖的提取与精制,发现猪苓菌丝多糖在抗肿瘤方面效果显著。

  参考资料

    1 章荣烈,猪苓提取物治疗肿瘤的实验研究.中华肿瘤杂志,1981,3(2):106.

    2 中医研究院广安门医院肿瘤科.猪苓多糖治疗肿瘤的研究(资料汇编),1979,2(3):85.

    3 中医研究院中药所药理室肿瘤组.猪苓提取物对小鼠移植性肿瘤的影响·猪苓多糖治疗肿瘤的研究(资料汇编),1979,1(2):20.       

  作者单位:030006山西省医药研究所 

  (收稿日期:2004-09-11) (编辑云 兆)

作者: 郭素萍 王德利 2005-9-22
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