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首页合作平台在线期刊中华中西医杂志2004年第5卷第5期论著

陕西人群TTV病毒的基因序列特征

来源:INTERNET
摘要:【摘要】目的了解陕西高危人群TTV病毒感染动态,探讨TTV病毒的基因特征与分型。方法采用PCR聚合酶链反应技术,提取TTV-DNA,进行基因测序。结果对240例肝炎患者和100例静脉吸毒者通过进行TTV-DNA检测,TTV-DNA阳性率分别为2。00%,基因测序分析,显示陕西TTV病毒与日本TTV毒株同源性高达95%以上。...

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【摘要】 目的 了解陕西高危人群TTV病毒感染动态,探讨TTV病毒的基因特征与分型。方法 采用PCR聚合酶链反应技术,提取TTV-DNA,进行基因测序。结果 对240例肝炎患者和100例静脉吸毒者通过进行TTV-DNA检测,TTV-DNA阳性率分别为2.08%和2.00%,基因测序分析,显示陕西TTV病毒与日本TTV毒株同源性高达95%以上。与国内AF351132株和AF072868株同源性分别为95.60%和96.31%。同时,在所提取的TTV-DNA反应模板中,发现有两种不同的TTV分子。结论 陕西人群存在TTV病毒感染与流行的潜在隐患,在血检过程中应增加TTV项目的检测,加强血源的管理

关键词 TTV PCR 基因测序

The detection and nucleotide sequence of TT virus in latent

 infected people in Shanxi province 

Xi Zhaoyan,Hu Xingju,Tian Xiaoping,et al.

Shanxi Provincial Centre for Disease Control and Prevention,Xi’an710054. 

【Abstract】 Objective To investigate the TT virus infection in latent infected people in Shaanxi province.and to detect the character and the type of theTT virus genes,this research was dine.Methods TTV-DNA was tested by using polymerase chain reaction.Results TTV-DNA infection was tested by polymerase chain reaction in serum samples of240hepititis patients with elevated alamine aminotrans ferase(ALT)and100drug abusers.The TTV-DNA positive were5cases and2cases separately The positive rates of TTV-DNA were2.08%and2.00%.To analyze2cases of them by nucleotide sequence,they clued on that the TT virus of Shanxi province was the same source as the Japanese isolate,and the same source rates was above95%.The AF351132isolate of China was the same source as the AF072868isolate,and the same source rates were95.60%and96.31%.At the same time we found two differents TTvirus molecular from TTV-DNA active pattern plate.Conclusion There are latent infection and epidemic of TT virus in people in Shanxi province.In order to control the dissemination of TT virus we should strengthen the control of the latent infected people especially the donator,and increase the TT virus projects of blood examination.

Key words TT virus polymerase chain reaction nucleotide seguence 

病毒性肝炎已成为众所周知的严重社会公共卫生问题。然而,在急慢性肝炎、散发性肝炎、暴发性肝炎中,还有相当比例的肝炎以目前的甲乙丙丁戊和庚型肝炎的实验室诊断方法,不能予以确认和分型。这一病因未明的病毒性肝炎,通常称为非甲~庚型肝炎,它给病毒性肝炎全面防治工作带来更大困难。

1997年,日本学者Nishizawa.T等在输血后肝炎中发现了这种非甲~庚型肝炎病毒,并命名为TTV病毒 [1] ,引起了世界学者的广泛关注。英国亦在正常人群中发现TTV感染率为1.20% [2]

国内,北京地区研究表明,健康人群TTV病毒感染率达22.0% [3] ,广东深圳地区正常人群TTV病毒感染率亦为7.80% [4]

为了解陕西人群TTV病毒感染的情况,探讨TTV病毒的基因特征与分型,我们对陕西省部分高危人群进行了TTV病毒检测和基因测序,现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取传染病院住院和门诊ALT指标异常的肝炎患者240例和戒毒所静脉吸毒者100例。均静脉抽取血液5ml,分离血清,-20℃保存。检测HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc、Anit-HCV、TTV-DNA、TTV基因测序。

1.2 材料和方法

1.2.1 仪器 全自动酶联分析仪(美国)、PCR分析仪(美国)、紫外分光透射仪(上海)、自动凝胶成像仪(UVITC/DBT-08)、全自动核酸测序仪(ABIPRISM TM 377XDLDNASequencer)。试剂:乙、丙型肝炎指标检测试剂,TTV核酸提取、PCR扩增试剂,基因测序DNA引物P15′-CAT GTT ATG AGA CTG G-3′、P25′-ATT TTA CCA TTT CCA-3′均由华美公司提供。

1.2.2 方法 用ELISA法检测HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc、Anti-HCV;检测TTV核酸:单槽式PCR扩增法。

1.2.2.1 模板反应物核酸(TTV-DNA)提取 取40μl裂解液于离心管,加20μl待测血清,震荡混匀,100℃煮沸15min,14000rpm离心5min,取上清液,即为反应模板。

1.2.2.2 基因扩增 基因扩增Ⅰ,取出PCR反应混合物Ⅰ,离心数秒,取26μl加入PCR反应管中,滴加两滴液体石蜡,然后加入2μl反应模板,离心数秒,即在PCR仪上进行94℃300s、94℃30s、55℃30s、72℃30s,循环30Cs予变性,再经72℃300s进行终延伸。

基因扩增Ⅱ,取出PCR反应混合物Ⅱ,离心数秒,取26μl加入PCR反应管中,滴加两滴液体石蜡,离心数秒,再取第一次扩增产物2μl加入各管中,即在PCR仪上进行条件同前的变性和延伸。

将扩增产物加入琼脂凝胶板,设置阳性、阴性对照,在100V电压下进行电泳。然后在紫外透射灯下观察电泳条带。样品和阳性对照在同一水平线上均出现橙色荧光带,即判断为结果阳性。并在自动凝胶成像仪上进行基因条带分析。

1.2.2.3 基因纯化 将裂解液及洗液37℃~55℃温浴,充分熔化混匀。加裂解液400μl,充分混匀,室温放置10min,14000rpm离心30s。再分别经乙醇、丙酮沉淀、六次14000rpm高速离心、清洗、干燥,即为纯化核酸。

1.2.2.4 基因测序 在基因测序仪上进行PCR产物直接测序(北京六合通基因发展有限公司)。

2 结果

2.1 在240例ALT异常的肝炎患者中 检出TTV-DNA阳性者5例,TTV-DNA阳性检出率2.08%;在100例静脉吸毒者中,检出TTV-DNA阳性者2例,静脉吸毒者TTV-DNA检出率2.00%,两人群之间差异无显著性(χ 2 =0.0024,P>0.05)。其中:男195例中,TTV-DNA阳性检出4例;女45例中,TTV-DNA检出1例。(见电泳图1)

图1 略

2.2 重叠感染 7例TTV-DNA阳性者,5例同时感染有HBV,2例感染HCV。其中:肝炎患者中重叠感染HBV、TTV者4例,重叠感染HCV、TTV者1例;吸毒者中重叠感染HBV、HCV、TTV者1例,重叠感染HCV、TTV者1例。

2.3 基因测序 对TTV-DNA阳性者,进行基因测序,其基因长度为261bp。

2.4 基因特征 陕西省ALT异常的肝炎患者和静脉吸毒者的TTV-DNA序列与日本TTV-DNA序列同源性达95%;与国内TTV-DNA序列同源性达95%以上。 

3 讨论

自1997年日本学者Nishizawa T等在输血后肝炎中发现TTV病毒以来,在世界范围内各国学者均对肝炎TTV病毒进行了积极的探索。认为该病毒可能是人类感染的又一种新型的导致肝脏病变的病毒,并可能呈世界性分布 [1]

本文针对陕西省静脉吸毒者(IVDUs)和ALT异常的肝炎患者进行了TTV病毒感染检测,TTV-DNA阳性检出率分别为2.08%、2.00%,虽低于日本和国内的有关报道 [5~7] ,但证实陕西人群存在TTV感染和流行的潜在隐患。

目前,研究趋向认为TTV病毒主要是经血和血制品途径传播。本研究中,肝炎患者和静脉吸毒者中重叠感染HBV、HCV的比例较高(5/7、2/7)。与马达等报道一致(重叠率达19.5%24/123) [2~9] 。同时,TTV病毒作为一种新型的肝炎致病因子和致病机制,有关研究提示,TTV感染与转氨酶升高有一定关系。Okamoto等研究发现在非甲~戊型爆发性肝炎中有42%为TTV-DNA阳性 [8] 。Simmonds等在21例原因不明的爆发性肝功能衰竭(FHF)病人中检出4例TTV感染者 [10] 。国内骆抗先等对单项转氨酶升高的病人进行基因分析,结果根据TTV的序列设计引物,在血清中均扩增出了与TTV有高度同源性的片段 [11] 。本文对5例转氨酶升高TTV-DNA阳性者的肝炎患者随访,获知4例均接受过输血,不能排除血源感染TTV的可能。据此,提示我们在防治病毒性肝炎策略上应高度重视,加强对血源的管理,在血液采检、应用过程中和对临床转氨酶升高的患者均应增加TTV的检测,防止TTV病原传播。

国外报道,TTV基因组由3800个核苷酸组成,不同株间核酸总的同源性在73.8%~96.5%之间。本文对检出的TTV-DNA通过基因测序分析,发现陕西省的TTV-DNA序列和日本的TTV-DNA序列同源性高达95%以上,与国内发现的AF351132株和AF072868株同源性分别达95.60%和96.31%。

资料介绍,TTV病毒存在基因变异。本次观察在肝炎患者和IVDUs

作者: 席昭雁 胡兴菊 田小平 王敬军 邢爱华 王百锁 李天来 吴华 2005-5-13
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