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首页合作平台在线期刊中华中西医杂志2004年第5卷第10期论著

无血清培养基对体外激活的A-NK细胞的支持作用(基金项目)

来源:INTERNET
摘要:基金项目:本课题受国家“九五”重点攻关课题(96-960A-01-20)和黑龙江省重点攻关课题(G00C190401)资助【摘要】目的研究多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用。方法分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞(A-NK)和非粘附NK细胞(NA-NK),比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细......

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  基金项目:本课题受国家“九五”重点攻关课题(96-960A-01-20)和黑龙江省重点攻关课题(G00C190401)资助

【摘要】 目的 研究多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用。方法 分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞(A-NK)和非粘附NK细胞(NA-NK),比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达粘附分子CD11 c 的能力,并通过电镜对A-NK细胞所杀伤的肿瘤细胞进行形态学观察。结果 与完全培养基培养细胞相比,AIMV培养细胞增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达CD11 c 的能力与之相当;在同一培养条件下A-NK细胞的增殖能力、杀伤活性及表达CD11 c 的能力明显强于NA-NK细胞;被A-NK细胞杀伤的肿瘤细胞死亡形式是溶解坏死和凋亡。结论 无血清培养基可替代完全培养基用于A-NK细胞的培养;A-NK细胞用于治疗肿瘤的过继免疫疗法要优于NA-NK细胞。

关键词 粘附NK细胞 无血清培养基 细胞培养 四甲基偶氮唑盐比色法

The culturing of IL-2-activated natural killer cells were

suported with serum-free medium AIMV in vitro

Wang Zhihua,Zhang Yan,Zhang Chunyan

Cancer Research Institute,Harbin Medical University,Harbin150040.

【Abstract】 Objective To compare serum-free medium AIMV with standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro.Methods Proliferation,cytotoxicity in vitro and expression of CD11 c of the cells cultured in the two different media were compared.To observe the tumor target cells killed by adˉherent natural killer cells(A-NK)through electroscope.Results Cells cultured in serum-free medium AIMV could proliferate,kill target cellsand express CD11 c well enough to substitute the cells cultured in standard serum-containing medium.Proliferation,cytotoxicity and expression of CD11 c of A-NK were better than nonadherent natural killer cells(NA-NK).Death patterns of tumor target cells were necrosis and apoptosis.Conclusion These data indiˉcate that serum-free medium AIMV could replace standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro,and A-NK was the better cells than NA-NK in adoptive immunotherapy.

Key words adherent natural killer cell serum-free medium cell culture MTT-assay

NK细胞是表型和功能上的异质性群体,根据在22nM(6000IU/ml)IL-2诱导下3~5h迅速粘附到塑料表面的能力,可将NK细胞分为两种不同的亚群:粘附NK细胞(adˉherent natural killer cell,A-NK)和非粘附NK细胞(nonadherˉent natural killer cell,NA-NK)。A-NK细胞代表外周血淋巴细胞的一小部分(4%~30%),由于其体外增殖和抗肿瘤能力强,对正常细胞无杀伤作用等优点,成为近年来肿瘤过继免疫疗法的研究热点。现在临床上常用于细胞培养的完全培养基,因含有人AB血清,虽经各种病毒的检测,但仍有可能传播其他疾病,而无血清培养基则可达到生物洁净要求,克服了添加人AB血清的缺点,对于免疫治疗的临床推广应用有重要意义。本研究力求找到一种新的方法,发展无血清培养基用于A-NK细胞的临床生物治疗,即不减少A-NK细胞的数量和活性,又能增加其临床应用的安全性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料 rhIL-2为南京军区军事医学研究所产品;淋巴细胞分离液、苯丙胺酸甲酯(PME)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品;PE标记的鼠抗人CD11 c 为美国Becton-Dickinson公司产品;RPMI1640培养液及无血清培养液AIMV为美国Gibco公司产品;人AB血清由哈尔滨市红十字中心血站提供,用于人A-NK细胞培养;胎牛血清为美国Hyclone公司产品,用于肿瘤细胞培养;人肺腺癌细胞Anip973和人红白血病细胞K562由本研究所建株传代。所用塑料培养瓶和培养板均为美国Costar公司产品,培养条件为37℃、5%CO 2 饱和湿化空气的培养箱中建立培养。酶标仪为BioRAU,450型,美国制造。

1.2 人外周血单个核细胞的制备 淋巴细胞分离液常规分离健康人的外周血单个核细胞,充分洗涤后,置于塑料离心管中用PME(5mmol/L)室温处理40min后充分洗涤备用。

1.3 A-NK细胞的诱导 用PME处理后的人外周血单个核细胞分别用完全培养基(RPMI1640,含10%人AB血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素)和无血清培养基AIMV在塑料培养瓶内培养,每组加rhIL-2(6000IU/ml)并调整细胞浓度为5×10 6 /ml。培养3~5h,移去含未粘附塑料表面的细胞悬液(即NA-NK细胞),收集粘附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞),分别重悬于各自含50%自体条件培养基的培养液中,调成细胞浓度为2×10 6 /ml,同时补充IL-2,细胞至终浓度为6000IU/ml,继续培养,每3天补充新鲜培养液和IL-2,细胞浓度和IL-2终浓度不变 [1]

1.4 细胞增殖活性的测定 采用改进的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 [2] 。于培养的第1,4,7,10和第14天分别取细胞,充分洗涤,以1×10 6 /ml浓度加入96孔平底板中,每孔0.2ml,设3个复孔,培养箱中培养48h后,每孔加MTT(5mg/ml)20μl,继续培养4h,然后翻板,每孔滴加100μl二甲基亚砜(DMSO)轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度(OD值),取3孔均值,OD值高则增殖快。

1.5 细胞杀伤活性的测定 采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定。靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞,效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞,效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔(E+T),效应细胞对照孔(E)和靶细胞对照孔(T),每组设3个复孔,操作方法同1.4。测定的OD值,取3孔均值,公式如下 [2] :细胞杀伤活性(%)=[1+(OD E+T -OD E )/OD T ]×100

1.6 细胞表型分析 细胞诱导3~5h后,分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK细胞,按5×10 5 个细胞/管,用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞 仪检测并分析CD11 c 的表达。

1.7 透射电镜标本制备 在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养,过夜,第二天取出离心(4000rpm×5min),用3%戊二醛固定30min(37℃)后按常规处理电镜标本。

1.8 统计学方法 采用样本均数的t检验

2 结果

2.1 AIMV与完全培养基培养细胞增殖能力的比较 实验表明,除了第10天AIMV培养的A-NK细胞测得的OD值明显低于完全培养基培养的A-NK细胞外(P<0.01),其他时间AIMV与完全培养基培养细胞的增殖能力相当,并无统计学意义;AIMV和完全培养基培养的A-NK细胞均大量增殖,OD值明显高于同一培养条件下的NA-NK细胞;不同条件培养的细胞均在第7天达到增殖高峰,结果见表1。

2.2 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的比较 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力相当,并无统计学意义;在同一培养条件下培养的A-NK细胞,其杀伤活性明显高于NA-NK细胞;IL-2诱导的第7天是细胞杀伤活性的高峰期,结果见图1。

表1 AIMV与完全培养基培养细胞OD值的比较

图1 AIMV与完全培养基培养细胞杀伤活性的比较

2.3 AIMV与完全培养基培养细胞表达CD11 c 能力的比较AIMV与完全培养基培养细胞24h后表达CD11 c 的细胞百分数相当;在同一培养条件下培养A-NK细胞表达CD11 c 的能力要高于NA-NK细胞。

2.4 透射电镜结果 透射电镜下可见A-NK细胞在靶细 胞周围形成花环,部分细胞变形,形成的突起或微绒毛伸向靶细胞,呈点状或斑状接触。溶解坏死的肿瘤细胞,细胞内浆网肿胀,线粒体内外膜分离,胞质中出现空泡变性,核染色质破碎,核膜质膜破裂,最终细胞崩解;凋亡的肿瘤细胞,可见核染色质固缩、偏移,形成典型的致密月牙槽形聚集在核膜内侧面,基质水肿变性,但核膜质膜完整。

3 讨论

本实验在制备A-NK细胞的方法上力求简便快速,利用NK细胞在22nM(6000IU/ml)IL-2诱导下,能在3~5h迅速粘附到塑料表面上的这一特性,将收集细胞的时间缩小到3~5h[1] 。由于以往采用尼龙毛柱过滤,操作复杂而难以推广应用,我们采用PME(5mmol/L)室温处理40min,以去除人外周血中某些抑制因素,如B细胞和单核巨噬细胞 [3] 。无血清培养基已经得到越来越广泛

作者: 王志华 张彦 张春艳 2005-5-18
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