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紫杉醇提取分离和分析检测研究进展*

来源:中国色谱网
摘要:紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属植物(Taxusspp。)中分离获得的、具有紫杉烷独特骨架的二萜类化合物。为解决紫杉醇的药源问题,国内外学者围绕红豆杉的栽培、紫杉醇的化学合成(包括全合成和半合成)、红豆杉组织细胞培养等领域进行了广泛的研究。据不完全统计,从各种红豆杉资源途径中已分离到200多种紫杉烷类化合物。...

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  紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属植物(Taxus spp.)中分离获得的、具有紫杉烷独特骨架的二萜类化合物。由于其良好的抗癌活性和独特的作用机理而受到广泛关注。为解决紫杉醇的药源问题,国内外学者围绕红豆杉的栽培、紫杉醇的化学合成(包括全合成和半合成)、红豆杉组织细胞培养等领域进行了广泛的研究。据不完全统计,从各种红豆杉资源途径中已分离到200多种紫杉烷类化合物。无论从天然红豆杉植物中还是从培养的植物细胞中提取紫杉醇,都涉及到如何分离并去掉与紫杉醇类似的化合物,因而,开发出高效快捷、经济实用的提取分离和分析检测手段显得尤为重要。本文拟对有关研究进展作一概述。

1 样品的预处理和紫杉醇的提取方法
样品的处理和紫杉醇的提取效果直接影响到分离及分析检测的效果。目前,围绕紫杉醇的提取方法,主要有以下几个方面的工作。
1.1 液-液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, LLE)的研究 
目前从植物或细胞培养物中提取紫杉醇的程序通常如下:先用甲醇、乙醇或二氯甲烷-甲醇(11)浸提,溶剂回收,所得浸膏用二氯甲烷-水或三氯甲烷-水进行分配萃取。这种提取方法简单易行,但所获浸膏杂质较多。Ketchum等
[1]在研究红豆杉细胞培养液中紫杉烷的分离时发现,在用0.2 μm的尼龙或聚偏氟二乙烯(PVDF)膜过滤水溶性培养液时,这些膜对紫杉烷类化合物有拦截作用,90%以上紫杉烷类化合物被收集在膜上,再利用一定比例的甲醇或乙醇水溶液洗脱就能使这些化合物通过膜。该方法可省去用溶剂分步提取或液-液分配这一步,节省大量溶剂,减少了环境污染。
1.2 固相萃取法(Solid Phase Extraction, SPE)的研究 
由于植物材料中紫杉醇含量很低,且成分复杂,给提取工作造成很大困难,简单的LLE操作又常导致高效液相色谱(HPLC)中柱的堵塞、污染以及回收率低、分离效果差等问题。SPE是一种具有省时间、省溶剂、萃取效率高以及有更好的选择性等优点的新型萃取方法,因而倍受青睐。Mattina等
[2]提出了用C18固相提取法从粗提物中大量分离收集紫杉烷类化合物,取得良好效果。分析生物样品中紫杉醇的含量,SPE已成为进行预处理时必不可少的一步。迄今为止,用于样品预处理的SPE柱有C2[3]、C8[4]、C18[2]和氰基柱[6]
1.3 超临界流体萃取法(Supercritical Fluid Extraction, SFE)的研究 
上述方法提取紫杉醇常需要大量的有机溶剂,回收利用困难。为减少污染,Jennigs等
[7]进行了SFE法提取紫杉醇的研究,利用二氧化碳及含乙醇的混合物为超临界流体,结果发现,短叶红豆杉树皮中紫杉醇的回收率达85%以上,选择性也好得多。该方法的局限是对仪器设备要求较高,限制了其应用。
1.4  柱切换技术(Column Switching Techniques)
柱切换技术是色谱分析中用于极其复杂样品分析的方法之一。利用切换阀改变不同的色谱系统,达到在线(On-line)样品净化、组分富集等目的。它对生物样品的药物分析具有很大潜力。液相色谱柱切换法实为一种在线的固相分离技术,常用一个长3~5 cm,填以粒径25~40 μm填料的预处理柱。选择一个低溶剂强度的预处理流动相使生物样品净化、富集;切换阀启动后,分析流动相将组分带入分析柱分离测定,测定结束后仪器自动恢复准备下次进样。较之上述提取方法,其优点是显而易见的,在紫杉醇的分析检测中也得到了广泛应用
[4,6~8]
此外,半制备性薄层色谱(TLC)也曾用于样品的预处理。

2 紫杉醇的分离和分析检测研究
为了研究紫杉醇及紫杉烷类化合物在植物体或其他样品中的含量,以及研究紫杉醇在体内的分布、代谢规律,已建立了许多定性定量方法。
2.1 色谱法(Chromatography)
二维薄层色谱技术早期曾用于紫杉烷类化合物的定性及半定量分析。TLC结合核磁共振(NMR)、质谱(MS)技术,已成功地分离获得多种新的紫杉烷类化合物,显示出在定性分析方面的优势。最近,Matysik等
[9]报道了一种分步梯度TLC结合光密度扫描定量测定紫杉醇的方法,该方法采用混合溶剂两步梯度展开,亦获得满意结果。
与TLC相比,HPLC在分离这类化合物方面更具优势,尤其是定量分析,因而得到广泛研究。紫杉醇的HPLC分析始于80年代末,随后得到了广泛应用(见表1)。正相、反相色谱均有应用,分离用到的固定相也有10多种。由于紫杉醇与其伴生的紫杉烷类化合物在化学结构和极性方面极为相似,因而分离纯化具有很高的难度。广泛应用的普通填料主要有ODS(C
18)、氰基柱和苯基柱。用这些填料的HPLC柱,虽然可以实现紫杉醇和三尖杉宁碱的分离,但却不能有效地分析出另一个非常难以分离的7-表-10-去乙酰基紫杉醇(7-epi-10-deacetyl-taxol)。为解决这一难题,已开发出包括diphenyl、pentafluorophenyl(PFP)在内的10多种新型填料。这些专门用于紫杉烷类化合物分离分析的HPLC柱,在测定紫杉醇含量时,排除了杂质干扰,使测定结果更准确可信,具有很好的分离效果。此外,具有极高柱效的微型柱(microcolumn)也有应用[16]

表1 紫杉烷类化合物的高效液相色谱分析

样品

固定相

流动相

参考文献

树皮,针叶

多孔石墨碳柱

二氧环己烷-水(46:54)

[10]

血浆,尿液

Octyl(C8)

乙腈-甲醇-水(4:1:5)+0.2mol.L-1醋酸铵(pH5.0)

[6]

细胞培养物

ODS(C18)

乙腈-水(52.5:47.5)

[1]

血浆,尿液

ODS(C18)

甲醇-水(13:7)

[3]

血浆,细胞培养物

ODS(C18)

乙腈-水(49:51)

[4]

血浆

ODS(C18)

甲醇-0.025mol.L-1二氯甲烷(梯度)

[5]

细胞培养物

ODS(C18)

乙腈-甲醇-水(1:4:5)

[11]

注射针剂

ODS(C18)

乙腈-42 m mol.L-1醋酸铵(2:3)

[12]

愈伤组织

ODS(C18)

乙腈-水-三氟乙酸(500:1540:5)(梯度)

[13]

愈伤组织

ODS(C18)

乙腈-甲醇-水(35:25:45)

[15]

注射针剂

Phenyl, diphenyl, PFP

乙腈-水(梯度)

[16]

树皮,针叶

Cyano(CN)

乙腈-甲醇-0.1molL-1醋酸铵(pH5.5)(26.5:26.5:47)

[17]

树皮,针叶

Metachem Taxsil

乙腈-水-30%甲醇(梯度)

[2]

注射针剂

Metachem Taxsil

乙腈/甲醇-水(10:90)(梯度)

[8]

愈伤组织

Phenomenex Taxsol

乙腈-水(52.5:47.5)

[1]

注射针剂

Whatman TAC-1 PFP

乙腈-水(梯度)

[16]

细胞培养物

Zorbax SW Taxsil

庚烷-甲醇(1:1)

[19]

  在HPLC分析方法方面,除了开发新型填料外,通过改变流动相的组成,或选择适当的洗脱方式,也能有效地解决上述问题。在分离过程中,采用的流动相通常为乙腈-水或甲醇-水二元溶剂系统。在流动相中加入磷酸盐缓冲溶液,或醋酸铵缓冲溶液,或采用乙腈-甲醇-水三元溶剂系统,均可以改善分离。此外,梯度洗脱方式也得到广泛采用,收到良好效果。
超临界色谱(Supercritical Fluid Chromatography, SFC)作为一种新兴色谱技术,兼具气相色谱和液相色谱的优点。Heaton
[20]等首次进行了SFC分离紫杉烷类化合物的工作。Jagota[21]等也研究了SFC分析紫杉醇的可能性,经与HPLC比较发现,SFC具有缩短时间一半,定量分析结果可比,且大量节省溶剂的优点。此外,高速逆流色谱(HSCCC)[14]也曾经用于紫杉醇和三尖杉宁碱的分离。
上面所提及的分离技术,绝大多数使用的是紫外检测器,检测波长多为225~230 nm,检测限为μg
.mL-1级。而Auriola[17]和Bitsch等[11]分别成功地实现了HPLC-MS联用技术,来分析检测紫杉烷类化合物,检测限可提高到ng级。至今,热喷雾[17]、电喷雾[11]、大气压电离(APCIMS)[3]质谱检测器都已应用到这一领域。此外,双质谱联用(Tandem MS)[18]技术也被用于红豆杉提取物的直接扫描,这一技术不需HPLC那样对样品进行分离,且灵敏度高(检测限达1 ng),所用时间少,能用来处理大量样品。
2.2 免疫学方法(Immunological Methods) 
近年来,免疫学新技术已被引入到药学研究领域,紫杉醇的研究便是一个成功的典范。1991年Jaziri
[22]等首次报道了用酶联免疫分析法(ELISA)半定量测定红豆杉植物及组织培养体中紫杉烷类化合物,研究发现,HPLC分离结果与ELISA分析结果有惊人的一致,表明ELISA作为紫杉烷类化合物的检测大有可为(见表2)。梅兴国等[24]以紫杉醇-牛血清白蛋白(BSA)为抗原免疫家兔,获得特异性抗紫杉醇抗体,结果表明其有较高的滴度(3.2×102)。ELISA法的测定范围是0.625~40.0ng.mL-1,回收率为92.8%~108.8%。而单克隆抗体(McAb)的应用则更是实现了紫杉烷类化合物研究开发的彻底革新。已获得了多个对紫杉醇具有高度特异性的McAb,研究表明,McAb在ELISA中比多抗有更灵敏的特异性,且远比HPLC灵敏度高,检测限可达0.6 ng.mL-1,此外该方法样品处理十分简单,适合于筛选高产细胞系中大量样品的快速扫描。

表2 免疫学方法用于紫杉烷类化合物分析

抗原

抗体

宿主

检测限/ng.mL-1

方法

参考文献

多抗

紫杉醇

牛血清白蛋白

兔子

23.5

ELISA

[22]

紫杉醇

牛血清白蛋白

兔子

0.10

RIA

[23]

紫杉醇

牛血清白蛋白

兔子

0.625

ELISA

[24]

10-去乙酰基巴可亭Ⅲ

牛血清白蛋白

兔子

0.09

ELISA

[25]

单抗

紫杉醇

牛血清白蛋白

小鼠

50

ELISA

[26]

紫杉醇

蝶蓝蛋白

小鼠

0.6

ELISA

[27]

巴可亭Ⅲ

蝶蓝蛋白

小鼠

13.7

ELISA

[27]

紫杉烷

蝶蓝蛋白

小鼠

0.6

ELISA

[27]

2.3 毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis,CE) 
毛细管电泳作为迄今分辨率最高的分离技术,应用日趋广泛。Chan等
[28]首次将高效毛细管电泳(HPCE)引入紫杉醇的分析,采用的是胶束电动色谱(MEKC)分离模式。Hempel等[29]则成功地将MEKC用于生物体液中紫杉醇的定量分析,检测中使用紫外检测器(228nm),检测限可达20ng.mL-1,线性范围为50~5000ng.mL-1,显示了良好的应用前景。
2.4 细胞生物学方法(Bioassay) 
紫杉醇是一种作用机理独特的新型抗癌药物,它通过诱导微管蛋白聚合,并阻止其解聚,从而抑制细胞分裂,达到抗肿瘤目的。根据这一性质,Shuler等
[30]进行了利用紫杉醇依赖性细胞系来筛选紫杉烷类化合物的研究,但该方法缺少专一性,限制了其应用。

3 结语
综上所述,对紫杉醇的提取分离和分析检测的研究已取得了长足的进展,一些新的技术和手段不断应用于这一领域,并显示出诸多优势和良好前景。但从目前研究情况看,反相HPLC仍发挥着主要作用。分析植物材料主要用苯基柱,而C
18柱则多用于生物样品的分离。样品的预处理多是先用甲醇浸提,然后用二氯甲烷-水进行液-液萃取,而目前SPE已成为继LLE之后的一个基本步骤。检测方法多采用紫外检测器,检测波长227~228nm。

*国家“八五”、“九五”重点科技攻关项目

作者单位:华中理工大学生物工程系 武汉430074
*通讯联系人  

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收稿日期:1998-10-05

 

作者: 梅兴国黄 伟* 2007-5-18
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