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分子生物技术在植物线虫学中的应用

来源:www.tcmgap.com
摘要:摘要:本文简要综述了生物技术近年来在植物线虫学研究中几个领域的应用,包括植物线虫种类的鉴定、植物线虫与寄主的相互作用、寄主抗性、生防、虫口动态等。关键词:生物技术植物线虫生物技术的飞速发展为研究植物---病原物之间的相互作用,提供了新的、强有力的工具和手段,使人们对它们之间关系的认识有了质的变化。植物......

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摘要:本文简要综述了生物技术近年来在植物线虫学研究中几个领域的应用,包括植物线虫种类的鉴定、植物线虫与寄主的相互作用、寄主抗性、生防、虫口动态等。
关键词:生物技术植物线虫

  生物技术的飞速发展为研究植物---病原物之间的相互作用,提供了新的、强有力的工具和手段,使人们对它们之间关系的认识有了质的变化。植物寄生线虫给水果产量、粮食产量造成严重的损害。随着人口不断增加,要求粮食产量越来越高,植物线虫研究显得越来越重要。近年来,植物线虫研究的各个领域使用了各种各样的生物技术。研究方面包括种的鉴定、小种和病理型的鉴定、抗病育种、植物线虫与寄主的相互作用、植物线虫虫口动态、优化轮作制度、生物防治和生防试剂等。
1植物线虫种类鉴定
  准确地鉴定植物线虫的种类是植物线虫学研究植物线虫防治,尤其是不用杀线剂防治植物线虫的基础。传统鉴定的方法是通过形态学鉴定,由于受环境和地理条件的影响相当大,有时并不可靠。特别是在种间进行鉴定时,难以找到合适特征。植物线虫研究应用分子生物学技术的直接目的就是使得鉴别植物线虫种类容易、准确和快速。鉴定植物线虫种类分子标记的使用增加了在样品中的鉴定的敏感性,加快了鉴定的速度。生物技术直接检测植物线虫的基因组,排除了环境变化的影响,从而快速准确地鉴定植物线虫种类。同功酶电泳、DNA标记、多聚酶链式反应(PCR)、限制性长度多态性(RFLP)等有人进行过综述,这里不再详叙。
1.1随机扩增多态性DNA(RAPD)和RAPD标记
  通过扩增染色体组DNA标记是一十分有效的方法。在作用上RAPD与RFLP类似,但具有一些比RFLP更优越的地方。RAPD鉴定方法是使用单个随机引物对用PCR扩增目标DNA,因此DNA片断产物分布在整个目标DNA池。RAPD分析可以不用知道植物线虫染色体顺序。用PCR技术只需微量的DNA,并且可以用于单个J2和单个孢囊的鉴定。在根结线虫鉴定中,对J2的鉴定特别有实用价值。RAPD分析可以成功地利用J2区分花生根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、北方根结线虫。十字花科孢囊线虫(H.cruviferae)和甜菜孢囊线虫(H.shachtii)也使用RAPD技术区分开来。并且检测到甜菜孢囊线虫的6个地理种群间的差异。用RAPD研究马铃薯金线虫和马铃薯白线虫种间和种内的差异,发现在种间250个扩增片断仅9个相同,而种内差异很少。几种穿孔线虫RAPD研究表明它们在基因组上,可以分为两组,R.brige、R.citri和R.similis的差异很大。通过使用RAPD技术对禾谷孢囊线虫(H.avence)11个种群进行分析,将它们分为禾谷孢囊线虫和不列颠病理型两个组,并澄清了禾谷孢囊线虫组中的原先的复杂关系。
  由RAPD扩增获得的DNA片断经鉴定后证明可以用作分子标记的称之为RAPD标记。通常把扩增的多态性DNA片断分离出来,经32P标记后,用作探针与DNA进行Southern杂交,那些与单拷贝或低拷贝数DNA片断杂交的扩增产物就可以用作分子标记。研究人员通过对根结线虫的RAPD标记片断克隆并进行测序,设计出一种专化性引物专门扩增标记片断,大大简化了RAPD标记检测程序。使用这种专化性引物可以很轻易地将北方根结线虫和奇特伍德根结线虫与其他几种根结线虫区分开来。
  有研究是依据核糖体重复ITS区的差异作为标记的,一些滑刃线虫和茎线虫种和生理小种的鉴定就是依据于此。在剑线虫组中ITS的相当大的差异也被观察到。但报道在几种根结线虫种间或种内的ITS1和ITS2区没有发现有差异。据报道核糖体重复的IGS区比ITS区有更大的变异,在相关种间很少保守。有人研究得出结论,南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫之间有较近的亲缘关系。
1.2扩增片断长度多态性(AFLP)
  扩增片断长度多态性(AFLP)是一种新的用PCR扩增DNA指纹技术,与RFLP相比,AFLP可以从毫克数量的单位的DNA扩增到无数个DNA标记。与RAPD相比,AFLP技术使用更严格的反应条件,以获得更好的扩增产物。AFLP技术可以定量分析,因此它可以作为共显性标记。在根结线虫的研究中,使用了两种方法。其一,根据线粒体的可变数目串联重复(VNTRs)在不同根结线虫线粒体的重复数目差异,扩增后电泳,比较带的差异,再进行计算确定它们之间的亲缘关系。目前,发现了根结线虫8、63、102碱基对的重复单元,63bp的重复单元顺序已经被测序。据此设计出专化性引物,扩增63bp单元。由于引物是专化性的,所以扩增产物也是特定的,电泳谱带所反应的是VNTRS在线虫中的分布。在根据公式K=1-∑nn=0X2I计算分布情况,可以得出它们的亲缘关系。其二,RAPs是在串联重复序列内或附近的点突变,并且在线粒体中这种点突变发生的频率比较高,因此RAPs可以用来揭示生物之间的亲缘关系。通过比较AFLP与RAPD在马铃薯金线虫的鉴定,显示它们的研究结果是一致的。
2植物线虫群体动态变化与防治
2.1耕地里植物线虫的动态变化
  花生根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫在各地往往同时存在,给轮作减少植物线虫虫口带来很大的困难。其中部分原因就在于无法准确地知道轮作前后土壤中植物线虫种类变化,各占多少。形态学鉴定是十分困难的,也不准确。而生物技术鉴定对此很有帮助,因为它可以通过RAPD或线粒体DNA标记的使用鉴别二龄幼虫。单个二龄幼虫的鉴定可以知道一个样品中的种类比例。耕地里的植物线虫群体是小种或病理型的混合体,情况就比较复杂了。传统的分类方法鉴定时不能鉴别到单个的植物线虫,鉴定的是土壤中的各个小种的平均状态。DNA标记与植物线虫侵染力或寄生基因连锁可以鉴定出单个植物线虫生理小种、生物型,因此可以鉴定出各个小种在土壤中所占的比例。弄清植物线虫在耕地里的种及种群的比例可以为合理轮作提供依据。研究植物线虫的地理分布对于评价抗病作物的来源有着积极的作用。在过去,鉴定植物线虫来源是十分困难的,现在采用DNA标记改变了这种情形,生物技术将成为主要手段。研究者将英国20个马铃薯白线虫分离物进行分类,发现20个种群亲缘关系密切,但与地理分布无关。
2.2生物防治植物线虫
  通过DNA和生化标记鉴定植物线虫寄生物的种类,分离和培养植物线虫寄生物防治植物线虫在生防上是有很大的潜力。在穿刺巴氏杆菌的单个群体和分离物中存在寄主专化性。这种专化性也许导致了孢子表面蛋白类型和数量的差异。穿刺巴氏杆菌寄主专化性的机制目前还不清楚。与寄主专化性有关的DNA标记也许可以帮助我们弄清楚其中的机制。正在进行的华美新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)基因工程鉴别出一个重要的决定性别的基因(her-1)。也许可以将这种基因转入感病的植物寄主中。如果它能表达,它的产物显然可以改变植物线虫的性别比例,增加雄植物线虫比例,减少雌植物线虫,达到减少植物线虫虫口的目的。
3植物线虫与寄主的互作关系
  植物线虫到底怎样建立寄生的是不清楚的。许多的作物都鉴定出了抗病品种,但是植物线虫的侵染力或寄生抗病基因知道得很少。马铃薯金线虫与Hi抗性基因有关的侵染力基因,正在进行研究。根结线虫、孢囊线虫和其他的一些内寄生线虫侵入和建立寄生关系,在植物线虫和寄主之间会产生一系列复杂的分子信号和反应。可能在不同的小种和病理型之间的分子信号差异是非常小的。使用单克隆抗体技术检测到了根结线虫和孢囊线虫分泌的蛋白质。最近,有人用单克隆抗体在根结线虫表面标记,研究其在模式寄主拟南芥菜根上的侵入过程和侵入后的相互作用。比较了几种根结线虫在根中的迁移速度,发现它们在根中的移动速度有差异。单克隆抗体技术的研究也许可以解释寄主与形成相互作用的分子机制。阐明它们之间相互作用的分子机制非常有用,也许可以据此设计出打破植物线虫与植物的寄生关系的农药。现在已经设计出植物线虫侵染时的受体分子。
4寄主对植物寄生线虫的抗性
4.1监测抗性基因的遗传
  许多栽培作物能够抗根结线虫或孢囊线虫。对植物线虫免疫的作物几乎没有,抗病的品种都是耐病和使植物线虫的侵染保持在低水平或者使植物线虫不能完成发育,以至于作物产量不受到影响。在作物抗性育种时,检测与抗病基因连锁的DNA标记鉴定抗性,可以大大缩短育种年限。例如,番茄抗性基因(Mi)和酸性磷酸酶的一种同功酶连锁,这种紧密连锁使得育种者可以通过检测这种DNA标记的存在而证实Mi基因是否被转入子代中。现在找到一种与Mi基因连锁更紧密的DNA标记。在甜菜抗孢囊线虫的育种中也发现一种DNA标记。
4.2植物抗线虫基因的克隆
  番茄抗根结线虫基因和甜菜抗孢囊线虫的基因就已被克隆。利用此技术也可以将克隆基因导入没有抗性但农艺性状好的品种。在传统育种将几种抗性基因转入一种作物是困难的,抗性基因常常与不良农艺性状基因连锁。生物技术使其成为可能。如果能做到这点,则植物可以抗更多种线虫或病理型,保持更持久的抗性。
4.3监测植物线虫的侵染力变化
  DNA标记不仅可以用来鉴定植物抗性,而且可以用来鉴定植物线虫对抗病植物的侵染性。使用这种方法鉴定了大豆孢囊线虫对几种抗病大豆的侵染力。
5展望
  在植物线虫学的研究中,利用生物技术工具和新方法有着广阔的天地。熟悉这些工具和方法,将很容易解决一些传统的方法所不能解决的问题。生物技术在植物线虫研究中的应用将在许多方面影响植物线虫学,从植物线虫的鉴定到抗病作物育种,将提高其有效性,从而增加防治手段。
来自:植物保护21世纪展望---暨第三届全国青年植物保护科技工作者学术研讨会论文

 

作者: 袁斌 彭德良 2005-4-8
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