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脾内免疫法制备抗α2-抗纤溶酶单克隆抗体

来源:中国免疫学杂志
摘要:α2-抗纤溶酶(α2-Antiplasmin,α2-AP)是由肝脏合成分泌的,含有452个氨基酸的单链糖蛋白,分子量为70000。α2-AP属于丝氨酸酶抑制物家族成员之一,在人血浆中α2-AP是主要的纤溶酶抑制物,在控制纤溶中起关键作用[1]。为此制备α2-AP单克隆抗体,建立ELISA方法用于纤溶系统的监测,为进一步提高抗原的免疫原性,减......

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  α2-抗纤溶酶(α2-Antiplasmin, α2-AP)是由肝脏合成分泌的,含有452个氨基酸的单链糖蛋白,分子量为70 000。α2-AP属于丝氨酸酶抑制物家族成员之一,在人血浆中α2-AP是主要的纤溶酶抑制物,在控制纤溶中起关键作用[1]。为此制备α2-AP单克隆抗体,建立ELISA方法用于纤溶系统的监测,为进一步提高抗原的免疫原性,减少抗原用量,延长抗原释放时间,用大分子惰性物质如硝酸纤维素膜(NC膜)作为抗原载体进行脾内包埋免疫。我们将抗原吸附于NC膜上,沿小鼠左肩正中线下胸背部纵形切口1 cm长,逐层入腹,轻轻牵出脾脏,以刀尖沿脾纵轴轻划一小口,置入1个三角形载有α2-AP抗原的NC膜,使之完全包埋于脾脏内,观察无出血后回纳脾脏,依次缝合伤口。间隔3 w后,用同样方法再进行1次,于加强免疫后第3天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(5∶1),用PEG-4000常规方法进行融合[2,3],HAT培养基选择培养,当克隆长至1/10孔大小时,采用间接ELISA法筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞株,并采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,建立了2株稳定分泌抗-α2-AP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H4和2E3,并用α2-AP采用常规方法免疫家兔,制备抗-α2-AP多克隆抗体血清。对其中的1株3H4进行研究,其杂交瘤染色体众数为96.37±1.90,分泌的抗体为IgG1亚类,kappa型。ELISA检测腹水效价1∶106,采用饱和硫酸铵盐析法从腹水纯化McAb 3H4,SDS-PAGE检测有较高纯度。3H4抗体对α2-AP标准品为阳性反应,而对ATIII及纤维蛋白原均为阴性,说明对其无交叉反应。此杂交瘤细胞株3 d传1代,体外传代培养6个月以上,ELISA检测抗体滴度无明显降低。采用ELISA法检测正常人血浆α2-AP含量,以纯化的McAb 3H4包板,兔抗α2-AP为多抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为三抗,以ABTS为底物,ELISA法检测了30名正常人枸缘酸钠抗凝血浆(1∶9)α2-AP含量,其结果为(98±1.99) mg/L。由此可见,制备α2-抗纤溶酶单克隆抗体用以检测α2-AP,对于了解肝病、血栓性疾病、DIC等许多疾病纤溶改变有着广泛的应用前景,并可用于溶栓治疗监测[4]。■

  ①中国医学科学院血液学研究所,天津300000

  作者简介:王玉亮,男,26岁,技师,从事细胞及分子生物学方面的研究

  参考文献:

  [1]李家增,贺石林,王鸿利主编. 血栓病学. 北京:科学出版社,1998:75-76

  [2]黄传书,金伯泉. 一种用于制备McAb杂交瘤的体内和体外联合免疫诱导法. 单克隆抗体通讯,1993;9(1):54

  [3]鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京:北京出版社,1995:193-198

  [4]Wohl R C,Sinio L,Robbins K C.Methods for studying fibrinolytic pathway components in human plasma .Thromb Res,1981;22:281

作者: 王玉亮黄繁墙穆红彭林李家增武文杰 2004-9-24
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